含有HMg-box的HmgB3在嗜热四膜虫细胞中的功能分析

摘要

高迁移率族蛋白（high mobility group protein，HMG）是一系列的染色体非组蛋白，普遍存在于真核细胞中。根据HMG蛋白不同序列的相似性以及与DNA结合的特性可将经典的HMG蛋白分为三类:HMGA，含有AT-hook结构域;HMGB，含有HMG-box结构域;HMGN，含有独特的核小体结合结构域。HMG-box高度保守，含有一个特征性的DNA结合结构域，即可由大约80个氨基酸形成3段α螺旋成“L”型折叠，其可插入到DNA小沟处并与DNA小沟相结合。包含有HMG-box的HMGB蛋白在细胞核内发挥着重要的作用，如参与DNA复制，转录，修复，重组，细胞的分化，凋亡等。嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）是一种单细胞的原生动物，具有核二态性，即一个二倍体的生殖小核和一个多倍体的体细胞大核。在四膜虫内，两种不同的HMGB家族蛋白HMG B和HMG C已经被研究，HMG C只定位于大核，HMG B在大核和小核中都存在，并且HMG B可能参与DNA复制。
　　本研究从四膜虫基因组数据库中鉴定了一种新的包含有HMG-box的基因HMGB3，对其结构及其定位进行了分析，获得的主要结果如下：⑴HMGB3的生物信息学分析HMGB3(TTHERM_00155590)拟编码670个氨基酸，在其N端含有一个HMG-box结构域，中间区域富含碱性的丝氨酸赖氨酸，C端则是一个中性的结构域，磷酸化分析表明C端结构域的S598，S602，S603，S612，S614，S615和S6167个位点可能被磷酸化从而形成一个酸性的C端结构域。RT-PCR结果表明HmgB3在营养生长时期只有很低的表达，在接合时期上调并在2～4 h达到最高值，这与Microarray分析的结果相一致。⑵HmgB3在细胞内的定位构建含有HA-tag的表达载体pBX-HA-HMGB3，并将其成功转化四膜虫细胞CU428和B2086，通过逐级增加巴龙霉素的浓度经过PCR鉴定获得稳定的阳性细胞株。通过对HA-HmgB3免疫定位发现，在营养生殖时期，HmgB3特异地定位于小核上。在饥饿时期，HmgB3则定位于小核的外周。在接合时期，HmgB3则特异地定位于有丝分裂和减数分裂的功能小核上，而在降解的小核中没有定位。过表达的HmgB3异常定位于新形成的大核上，进而导致有性生殖产生的子代的存活率仅达正常的50％左右。⑶截短型HmgB3在细胞内的定位为了研究HmgB3特异地定位机制，我们构建了不同的HmgB3的截短型表达载体以了解HmgB3的不同结构域在HmgB3定位中所起的作用。通过免疫荧光定位发现，双截短HMG-box和C端结构域的HMGB3△NC细胞株，HmgB3△NC弥散到胞质当中;C端结构域的去除并不会对HmgB3△C的定位产生影响。但是，一旦截了HMG-box结构域，HmgB3△N则完全弥散到胞质当中。这表明HMG-box结构域对HmgB3特异地定位于小核是必需的。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 HMG的发现

1．2 HMG-box的结构及功能

1．2．1 HMG-box的结构

1．2．2 HMG-box的功能

1．3 四膜虫的特点及其本课题的意义

1．3．1 四膜虫的生物学特征及其研究优势

1．3．2 本课题的研究意义

参考文献

第二章 嗜热四膜虫中HMGB3基因的鉴定及其序列分析

2．1 前言

2．2 材料

2．2．1 菌株和质粒

2．2．2 试剂与工具酶

2．2．3 实验所用引物

2．2．4 主要实验仪器

2．2．5 主要试剂配制

2．3 方法

2．3．1 嗜热四膜虫细胞的培养、饥饿与交配

2．3．2 嗜热四膜虫HMGB3基因的克隆

2．3．3 HMGB3基因的生物信息学分析

2．3．4 HMGB3基因的表达谱分析

2．4 结果

2．4．1 HMGB3基因序列的克隆

2．4．2 HMGB3基因的序列分析

2．4．3 HMGB3基因的表达谱分析

2．5 讨论

参考文献

第三章 嗜热四膜虫中HmgB3在营养生殖和接合时期的定位

3．1 前言

3．2 材料

3．2．1 菌株和质粒

3．2．2 试剂与工具酶

3．2．3 实验所用引物

3．2．4 主要实验仪器

3．2．5 主要试剂配制

3．3 方法

3．3．1 嗜热四膜虫细胞的培养、饥饿和交配

3．3．2 嗜热四膜虫pBX-HA-HMGB3表达载体的构建

3．3．3 四膜虫细胞转化

3．3．4 阳性克隆的筛选

3．3．5 四膜虫基因组的快速提取

3．3．6 免疫荧光定位

3．3．7 HmgB3蛋白的过表达

3．4 结果

3．4．1 pBX-HA-HMGB3的构建及其重组鉴定

3．4．2 HmgB3在四膜虫营养生殖和饥饿时期的定位

3．4．3 HmgB3在四膜虫接合时期的定位

3．4．4 HmgB3过表达对四膜虫有性生殖的影响

3．5 讨论

参考文献

第四章 嗜热四膜虫中HMG-box对HmgB3特异性定位是必需的

4．1 前言

4．2 材料

4．2．1 菌株和质粒

4．2．2 试剂与工具酶

4．2．3 实验所用引物

4．2．4 主要实验仪器

4．2．5 主要试剂配制

4．3 方法

4．3．1 嗜热四膜虫截短型pBX-Tr-HMGB3载体的构建

4．3．2 四膜虫细胞转化

4．3．3 阳性克隆的筛选

4．3．4 免疫荧光定位

4．4 结果

4．4．1 pBX-Tr-HMGB3的构建及其重组鉴定

4．4．2 HMG-box对HmgB3蛋白特异地定位于小核是必需的

4．5 讨论

参考文献

附录

总结与展望

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简况及联系方式

声明