飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因克隆及表达特征

摘要

谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)是一类由多基因编码、具有多种生物功能的同工酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，是生物体内重要的解毒酶系之一，与昆虫的抗药性相关。本文以飞蝗为材料，从分子生化水平对谷胱甘肽硫转移酶进行了系统研究，深入探索了飞蝗GSTs的mRNA表达模式和蛋白表达特征，为进一步研究飞蝗GSTs的生物功能提供了基础资料，以期为飞蝗防治新技术的开发提供实践依据。主要内容如下:
　　 一、飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因克隆及序列分析
　　 通过对飞蝗转录组数据分析比对，获得GSTs序列片段，采用RACE-PCR技术获得32条谷胱甘肽硫转移酶cDNA全长序列，经系统进化聚类分析，结果表明，28个属于胞液GSTs，分别属于Sigma（LmGSTs1，LmGSTs2，LmGSTs3，LmGSTs4，LmGSTs5,LmGSTs6,LmGSTs7,LmGSTs8,LmGSTs9,LmGSTs10）、Omega(LmGSTo1，LmGSTo2,LmGSTo3)、Epsilon(LmGSTe1,LmGSTe2,LmGSTe3,LmGSTe4,LmGSTe5)、Delta(LmGSTd1,LmGSTd2,LmGSTd3,LmGSTd4,LmGSTd5,LmGSTd6,LmGSTd7)、Theta(LmGSTt1,LmGSTt2)、Zeta(LmGSTz1家族，其余4个为MEPEG家族(LmGSTM1，LmGSTM2,LmGSTM3，LmGSTM4)。
　　 二、飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因的表达模式
　　 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术，检测飞蝗谷胱甘肽硫转移酶在成虫不同组织部位（前肠、中肠、后肠、胃盲囊、马氏管、表皮、精巢、卵巢、脂肪体、气管、触角、肌肉）以及不同发育时期（卵期、1-5龄若虫和成虫）的表达情况。结果发现:GSTs在不同组织部位表达比较广泛，其中在消化和排泄系统高表达的有LmGSTs2、LmGSTs4、LmGSTs6、LmGSTs10、LmGSTd4、LmGSTd6、LmGSTe2、LmGSTe5、LmGSTM3;在肌肉中表达量相对较高的有LmGSTs1、LmGSTo2、LmGSTo3、LmGSTd3、LmGSTd5、LmGSTd7、LmGSTe3、LmGSTt1、LmGSTt2;在触角中表达量相对较高的有:LmGSTs3、LmGSTs7、LmGSTo1、LmGSTd1、LmGSTe4、LmGSTM2;LmGSTM1主要在精巢中表达;LmGSTs8、LmGSTs9主要在精巢、卵巢、触角和肌肉中表达。LmGSTs5和LmGSTe1在脂肪体中表达量较高，其余基因在所检测的组织部位表达量都比较低，且没有明显的变化。GSTs基因在飞蝗不同发育阶段的表达模式可划分为两类，即卵早期高表达和若虫期高表达。其中LmGSTs3、LmGSTs8、LmGSTd1、LmGSTd3、LmGSTd3、LmGSTd7、LmGSTe2、LmGSTe3、LmGSTe4、LmGSTe5、LmGSTo1、LmGSTz1主要在卵期高表达;LmGSTs2、LmGSTs7、LmGSTsd6在卵发育后期开始表达，随着虫体进入若虫到成虫，该基因的表达量逐渐增高，到成虫表达量达到最高。LmGSTs4、LmGSTs5、LmGSTs6、LmGSTs10、LmGSTM3从一龄若虫期开始随着龄期的增加表达量逐渐增高，除LmGSTs10在成虫期表达量有所下降外，其余5个基因在成虫期表达量达到最高。LmGSTd4从一龄若虫开始高表达，到4领若虫达到最高水平，此后表达量开始逐渐降低。LmGSTo2、LmGSTo3、LmGSTM2在卵后期表达量最低。其余基因的表达量在飞蝗的整个发育阶段没有明显差异。
　　 选择卵期高表达的12个基因，进一步检测其在卵期不同发育时间段的表达情况，结果显示:LmGSTd1、LmGSTd3、LmGSTd5、LmGSTe2、LmGSTe3、LmGSTe4、LmGSTs3、LmGSTs8表达量总体表现为卵前期高于卵后期;LmGSTo1随着卵的发育，表达量逐渐增高;LmGSTd7和LmGSTe5在卵发育中期表达量最低，呈现出“Ⅴ”型表达模式，而LmGSTz1在卵发育中期表达量相对较高。GSTs基因的表达多样性，暗示其可能在飞蝗不同组织部位和不同发育阶段发挥不同的生物功能。
　　 三、飞蝗谷胱甘肽硫转移酶原核表达及蛋白活性分析
　　 采用大肠杆菌表达系统成功表达并纯化获得17个可溶性GST重组蛋白。以CDNB为底物，检测重组蛋白的催化动力学参数Vmax、KmCDNB和KmGSH。结果表明:所有GSTs对CDNB都有催化活性，转换数Kcat在0.68×102s-1-3.33×104s-1之间;米氏常数Km值存在差异，其中KmCDNB差异相对较大，而同一家族的KmGSH值相对一致;以6种不同化合物(2，4-Dinitrochlorobenzene(CDNB)、3,4-Dichloronitrobenzene(DCNB)、2,4-Dinitrofluorobenzene(FNDB)、4-Chloro-7-nitrobenzofurazan(NDB-Cl)、4-Nitrobenzylchloride(pNBC)、4-Nitrophenethylbromide(pNPB)）为底物，检测GSTs对其催化比活性，结果显示:各家族GSTs对不同底物催化活性差异较大，但家族成员之间总体趋势相对一致，表现为:Epsilon家族GSTs对6种不同底物都有较高的催化活性，Sigma家族GSTs对FNDB的催化活性最高，对pNBC没有检测到催化活性;Delta家族GSTs对FNDB和NDB-Cl催化活性较高，其中LmGSTd1和LmGSTd6对FNDB的比活性分别达到125μmol/min/mg和76μmol/min/mg;LmGSTt1对pNBC和pNPB有显著的活性。LmGSTo2和LmGSTz1对6种底物的催化活性都比较低，对DCNB、pNPB和pNBC没有检测到生物学活性。通过对GSTs的谷胱甘肽过氧化物酶活性(GPX)研究发现:LmGSTt2有很高的GPX活性，达到了306U/mg;其次是LmGSTe1，比活性为92U/mg;而LmGSTs4、LmGSTs9、LmGSTe4、LmGSTd7、LmGSTo2和LmGSTz1未检测到GPX活性，其余都有较低的活性，比活性范围在4-25U/mg之间。通过对GSTs的活性特征分析，推测不同GSTs在飞蝗体内发挥不同的生物学功能，同一家族的功能可能具有一定的相关性，而LmGSTt2和LmGSTe1可能参与飞蝗体内过氧化物的降解过程。

目录

摘要

第一章 前言

1 飞蝗概述

1．1 飞蝗分布、特征及生活习性

1．2 飞蝗为害与防治

2 谷胱甘肽硫转移酶概述

2．1 谷胱甘肽硫转移酶的分类及序列结构特征

2．2 谷胱甘肽硫转移酶的生物功能

2．3 谷胱甘肽硫转移酶与昆虫抗药性的关系

3 研究目的及意义

第二章 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因克隆及序列分析

1 实验材料

1．1 供试昆虫

1．2 供试试剂

1．3 主要仪器

2 研究方法

2．1 序列来源及引物设计

2．2 飞蝗总RNA提取及第一链cDNA合成

2．3 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因5’末端和3’末端cDNA序列扩增

2．4 RACE-PCR产物回收和纯化

2．5 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆和测序验证

2．6 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因聚类分析

2．7 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶氨基酸序列比对

3 结果与分析

3．1 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶cDNA全长序列信息

3．2 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶氨基酸聚类分析

3．3 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶全长序列的克隆

3．4 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶氨基酸序列比对分析

4 讨论

第三章 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶mRNA表达模式

1 实验材料

1．1 供试昆虫

1．2 供试试剂

1．3 主要仪器

2 研究方法

2．1 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因表达引物的设计

2．2 飞蝗不同组织部位及不同发育阶段总RNA的提取、纯化及cDNA合成

2．3 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因在成虫不同不同组织部位的表达

2．4 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因在不同龄期的表达

2．5 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因在卵期不同发育阶段的表达

3 结果分析

3．1 谷胱甘肽硫转移酶基因在飞蝗成虫不同组织部位的表达

3．2 谷胱甘肽硫转移酶基因在不同龄期的表达分析

3．3 谷胱甘肽硫转移酶基因在卵期不同发育阶段的表达分析

4 讨论

第四章 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶原核表达及活性分析

1 研究材料

1．1 供试材料

1．2 供试试剂

1．3 主要仪器

2 研究方法

2．1 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因原核表达引物的设计

2．2 重组质粒的构建

2．3 重组蛋白的表达验证

2．4 重组蛋白的纯化

2．5 重组蛋白含量的测定

2．6 重组蛋白的动力学参数Km和Vmax的测定

2．7 重组蛋白对不同底物催化活性的测定

2．8 重组蛋白的谷胱甘肽过氧化物酶活性测定

3 结果与分析

3．1 LmGSTs的表达及纯化

3．2 LmGSTs的动力学参数

3．3 LmGSTs对不同底物催化活性分析

3．4 LmGSTs的GPX活性测定

4 讨论

结论与展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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