LiCl对IDH2突变的神经胶质瘤细胞增殖及迁移影响的研究

摘要

神经胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤，具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低的“三高一低”的特点，依照WHO组织病理学和临床标准，人类大脑神经胶质瘤分为Ⅰ-Ⅳ级，WHOⅣ级被认为是神经胶质母细胞瘤，在成年人群中，是主要盛行和恶性的原始大脑肿瘤。
　　 异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是一类酶家族，在人基因组中，有5类IDH基因可编码3类异柠檬酸脱氢酶:IDH1，IDH2和IDH3，均可催化异柠檬酸(ICT)生成还原性辅酶(NADPH)和α-酮戊二酸(α-KG)。研究发现，IDH1(R132)突变在继发性胶质母细胞瘤和低级别神经胶质瘤中发生率较高，IDH2(R172)突变则较低，IDH1和IDH2突变都是单一位点的氨基酸突变。IDH1突变后其催化活性降低，相对应的酶促反应产物NADPH和α-KG的产量下降，但同时又使其获得了一种新的酶促活性，催化NADPH和α-KG生成2-HG。IDH突变后，细胞内HIF-1α稳定性提高，进而调节其下游靶基因的表达，促进肿瘤细胞的生长。
　　 当前，肿瘤细胞内微环境是癌症研究领域的核心问题，对肿瘤生长、迁移的生物学机制的正确理解，有助于为针对神经胶质瘤的增殖和迁移相关信号分子的靶向药物的设计和筛选提供理论和实验依据。本课题拟在前期工作和思路的基础上，探讨在IDH突变的真实细胞内环境下，氯化锂在调节神经胶质瘤中与增殖和迁移相关的信号分子的作用机制。本实验首先将穿梭质粒pEGFP-N1、重组质粒pEGFP-N1-IDH2R172G和pEGFP-N1-IDH2转染大鼠神经胶质瘤C6细胞株，通过WesternBlot实验检测细胞内低氧诱导因子(HIF-1α)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)、血管内皮生长因子(VEGF)和M2型丙酮酸激酶(M2-PK)的蛋白表达水平，利用明胶酶谱实验，对基质金属蛋白酶-2，9（MMP-2，9）的分泌水平进行检测。实验结果表明，IDH2突变可提高细胞内HIF-1α稳定性，CyclinD1、VEGF、MMP-2，9、M2-PK的表达量明显提高。说明IDH2突变后，酶活性下降，导致催化产物α-KG量减少，HIF-1α稳定性提高，进而引起HIF-1α的下游靶基因CyclinD1、VEGF、MMP-2，9的表达量提高。体外划痕擦伤实验结果表明，在pEGFP-N1-IDH2R172G处理组中，划痕两侧细胞向划痕中央生长的速度较pEGFP-N1和pEGFP-N1-IDH2处理组快。
　　 LiCl是应用在治疗抑郁症和极端情绪方面重要的药物，可抑制肌糖单磷酸酶和糖原合酶激酶-3(GSK-3)活性。GSK-3是在所有真核细胞中发现的一种多功能的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，可以调节许多过程，包括新陈代谢、细胞分化和死亡等。LY294002可通过抑制Akt磷酸化等来抑制PI3K/Akt信号途径，从而使GSK-3β磷酸化水平降低，活性提高。本研究利用LiCl和LY294002对细胞内GSK-3β的磷酸化水平进行调节，分析细胞内GSK-3β的磷酸化水平对IDH2突变的C6细胞株增殖活力的影响。WesternBlot实验结果表明，LY294002可以降低GSK-3β的磷酸化水平，而LiCl不能再提高已经被LY294002处理过的C6细胞内的GSK-3β的磷酸化水平，MTT实验结果表明，LY294002可以抑制细胞的增殖活性，并且pEGFP-N1-IDH2组的抑制率总是高于pEGFP-N1组和pEGFP-N1-IDH2R172G组，而LiCl对LY294002处理之后的C6细胞的增殖活性没有影响。
　　 接着，本实验分析了LiCl对IDH2突变的C6细胞迁移和增殖的影响，MTT实验结果表明，锂离子可以降低细胞的增殖活性，推测是由于锂离子抑制GSK-3β的活性之后，导致细胞内糖代谢发生紊乱，诱导了细胞的凋亡。在C6细胞中，无论IDH2是否发生突变，锂离子均可以导致HIF-1α的稳定性降低，从而使C6细胞的增殖能力受到抑制，并且在野生型IDH2处理组中，HIF-1α稳定性降低的程度高。在对照组EGFP和野生型IDH2处理组中，LiCl可使β-catenin核积累量提高，但在突变型IDH2处理组中，β-catenin核积累量却降低。通过明胶酶谱实验表明，在pEGFP-N1-IDH2R172G处理组中，MMP-2和MMP-9分泌水平提高的程度不如pEGFP-N1和pEGFP-N1-IDH2处理组中高，说明MMP-2和MMP-9分泌水平的提高还是由于IDH2突变的原因，Wnt/β-catenin信号通路只是起到了比较微弱的作用。
　　 本研究工作试图揭示LiCl对IDH突变的神经胶质瘤细胞中相关信号通路分子调节作用，确定其抑制肿瘤细胞增殖和迁移的分子机制，进一步充实对目前有关IDH突变与神经胶质瘤生长和迁移关系的研究。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)突变对胶质瘤细胞中HIF-1α的影响

1．1．1 神经胶质瘤

1．1．2 IDH突变的特点以及对HIF-1α的影响

1．2 HIF-1α对下游靶基因MMPs，VEGF和Cyclin D1表达的影响

1．3 LiCl对肿瘤细胞中Wnt／β-catenin及其他通路的调控作用

1．4 研究LiCl与IDH突变之间的关系和意义

1．5 论文设计思路

1．5．1 研究背景

1．5．2 实验目的和主要研究内容

1．5．3 实验方案及流程

1．5．4 研究的创新点

第二章 C6细胞中IDH2突变对其迁移和增殖的影响

2．1 实验材料

2．1．1 细胞和质粒

2．1．2 酶和生化试剂

2．1．3 试剂的配制

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 三种质粒转染C6细胞

2．2．3 三种质粒转染C6细胞后细胞内HIF-1α、C!yclin D1、M2-PK以及培养基内VEGF的表达水平分析

2．2．4 免疫荧光检测实验

2．2．5 明胶酶谱实验

2．2．6 体外划痕擦伤实验

2．3 实验结果

2．3．1 三种质粒转染C6细胞后细胞内HIF-1α、Cyclin D1、M2-PK以及培养基内VEGF的水平变化

2．3．2 C6细胞内HIF-1α和VEGF的免疫荧光检测结果

2．3．3 明胶酶谱检测C6细胞内MMP-2，9的分泌水平

2．3．4 体外划痕擦伤检测C6细胞的迁移能力

2．4 讨论

第三章 GSK-3β的磷酸化对IDH2突变的C6细胞增殖活性的影响

3．1 实验材料

3．1．1 细胞和质粒

3．1．2 酶和生化试剂

3．1．3 试剂的配制

3．1．4 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 三种质粒转染C6细胞

3．2．3 LiCl处理细胞

3．2．4 LY294002处理细胞

3．2．5 LiCl和LY294002作用分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内GSK-3β的磷酸化水平分析

3．2．6 LY294002作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响

3．2．7 LY294002和LiCl先后作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响

3．3 实验结果

3．3．1 LiCl作用分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内GSK-3β的磷酸化水平变化

3．3．2 LY294002作用分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内GSK-3β的磷酸化水平变化

3．3．3 LY294002和LiCl先后作用分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内GSK-3β的磷酸化水平变化

3．3．4 LY294002作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响

3．3．5 LY294002和LiCl先后作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响

3．4 讨论

第四章 LiCl对IDH2突变的C6细胞迁移和增殖的影响

4．1 实验材料

4．1．1 细胞和质粒

4．1．2 酶和生化试剂

4．1．3 试剂的配制

4．1．4 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 细胞培养

4．2．2 三种质粒转染C6细胞

4．2．3 LiCl处理细胞

4．2．4 LiCl作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响

4．2．5 明胶酶谱实验

4．2．6 体外划痕擦伤实验

4．2．7 LiCl作用分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内HIF-1α的表达水平分析和β-catenin的核积累量的分析

4．3 实验结果

4．3．1 LiCl作用分别转染三种质粒的C6细胞后对细胞增殖活力的影响

4．3．2 明胶酶谱检测C6细胞内MMP-2，9的分泌水平

4．3．3 体外痕擦伤检测LiCl对C6细胞迁移能力的影响

4．3．4 LiCl对分别转染三种质粒的C6细胞后细胞内HIF-1α的表达水平和β-catenin在细胞核积累量的影响

4．4 讨论

参考文献

总结与展望

附录

致谢

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