联苯培养条件下红球菌R04转录应答及其中间代谢物原儿茶酸的生物转化

摘要

随着对多氯联苯（PCBs）生物降解过程中代谢动力学和代谢机理的研究日趋成熟，人们对多氯联苯代谢菌的研究逐渐转移到了基因组和转录组水平上，基因组和转录组研究不仅能够从根本上揭示特定生物学过程的分子机理，还能直观监测整个细胞代谢特征，进而获得联苯/PCBs胁迫下，微生物相关细胞生理调节反应和联苯通路可能存在的辅助机制信息。
　　为了研究不同碳源培养条件下,特别是联苯条件下红球菌的细胞转录应答，挖掘与多氯联苯（PCBs）转运、代谢及其调控相关的基因，为进一步全面理解 PCBs微生物降解的分子机制奠定基础。本课题以一株多氯联苯降解菌红球菌（Rhodococcus sp. R04）为材料，分别提取不同碳源（乙醇、葡萄糖和联苯）培养条件下菌体的总RNA，反转录合成 cDNA。采用高通量测序法分别对这三种样品进行转录组测序，分析测序数据得出全基因组表达模式，并对不同条件下的基因表达进行差示分析，进而对联苯代谢网络和红球菌中其他基因的转录调节和代谢应答反应做出相关性分析。并通过 Q-RT-PCR分析不同碳源培养条件下的基因表达情况。测序结果表明，与葡萄糖和乙醇相比，联苯培养条件下显著上调（log2 Ratio≧1）基因个数分别为375和332个。与葡萄糖相比，联苯培养条件下相关基因上调表达量与Q-RT-PCR实验结果基本一致。功能分类获得细胞组分、分子功能和生物学过程三大类别160多个细小分支的差示表达基因，部分基因参与联苯代谢转录调控、联苯转运、抗氧化应激反应以及信号传导通路系统等多种生理过程。参与联苯上游代谢途径的众多同工酶基因中，只有bphC2和bphD1在联苯中大量上调表达，其余同工酶在联苯中基本量不变或下调表达。转录组注释及差示分析推测，红球菌 R04中苯甲酸的代谢主要是通过儿茶酚邻位途径、间位途径以及原儿茶酸途径三条代谢途径完成。与葡萄糖和乙醇相比，红球菌 R04在联苯培养条件下基因表达差异明显，这为我们进一步解析多氯联苯代谢特征和代谢调控提供理论依据。
　　原儿茶酸是多种中药的主要活性成分和多种药物的前体物质，其生物学功效具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗炎等作用。目前国内市场对原儿茶酸需求量逐年增长，其生产方法主要是采用化学化工法从植物中抽提，提取工艺复杂，在多步提取过程中都有不同程度的损耗，提取率低，且对生态环境造成一定破坏。本课题从生物转化角度解决原儿茶酸生产工艺中的各种问题，首次运用生物酶催化法生产原儿茶酸。将对羟基苯甲酸-3-羟化酶基因重组表达在大肠杆菌 BL21(DE3)细胞中，成功构建了一株高效生产原儿茶酸的工程菌，实现了原儿茶酸的绿色催化。此外，本课题对实验条件进行优化以提高原儿茶酸的产率，底物对羟基苯甲酸在每 OD菌液中转化量可达到250~300μg。

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第一章 前言

1.1 转录组研究概况

1.2 红球菌联苯代谢及相关同工酶

1.3苯甲酸代谢及中间代谢产物

1.4 本课题研究的目的和意义

参考文献

第二章 联苯培养条件下红球菌R04的转录表达

2.1 材料

2.2方法

2.3结果与讨论

参考文献

第三章 联苯培养条件下红球菌R04联苯代谢途径解析

3.1 材料

3.2方法

3.3结果与讨论

3.4 讨论

参考文献

第四章 原儿茶酸的生物转化

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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