抗沉默因子Asf1调控嗜热四膜虫细胞核的稳定性

摘要

组蛋白分子伴侣能协助组蛋白参与染色质的组装和解凝，进而调控基因的表达，对核小体的组装解凝起到了重要作用。不同组蛋白分子伴侣对核小体装配解凝有不同的作用，进而影响核小体的稳定性、结构以及染色体状态，从而影响生物的发育过程。高等真核生物细胞中组蛋白异二聚体H3/H4的分子伴侣Asf1(anti-silencing function1，Asf1)参与依赖DNA复制及不依赖DNA复制的核小体装配，同时参与转录调控，基因沉默以及DNA损伤修复等过程，在不同生物中Asf1具有一定的功能保守性，同时进化出新的功能。
　　嗜热四膜虫是一种重要的真核模式生物，细胞包含一个二倍体的生殖小核和一个多倍体的体细胞大核。在营养生长时期，嗜热四膜虫细胞小核进行有丝分裂，而大核进行无丝分裂；在有性生长时期，细胞进行配对，小核通过减数分裂和有丝分裂产生配子核，新大核通过合子核基因重排形成，亲本大核凋亡。四膜虫核的二态性及多样化的核发育形态成为研究组蛋白及其分子伴侣重要的模式体系。本研究对组蛋白分子伴侣Asf1在四膜虫细胞中的功能进行了系统分析，获得主要结果如下：
　　1.嗜热四膜虫中ASF1基因生物信息学分析嗜热四膜虫ASF1（TTHERM_00442300）基因全长756 bp，无内含子，预测编码的 N端1～155位是保守的Asf1功能结构域，酸性 C端区域参与调节功能，N端结构域序列同源进化树分析表明， Asf1的分子进化与物种进化基本一致。RT-PCR结果表明，ASF1在嗜热四膜虫的各个时期均有表达，并且在有性生殖4~6h转录水平达到最高。
　　2. HA-Asf1定位在大核和小核我们构建了重组质粒pNeo-HA-ASF1，并将其转化四膜虫细胞，巴龙霉素抗性条件下筛选得到稳定表达HA-Asf1的细胞株。通过免疫荧光定位分析表明，HA-Asf1在营养生长时期，饥饿时期以及有性生长时期定位于大核、小核以及新形成的大小核中，发育前期大核的信号更强，而到了Anlagen时期小核信号增强，而在即将凋亡的亲本大核中，定位信号逐渐减弱最后消失。
　　3.过表达ASF1后核变大并影响细胞的增殖构建过表达pXS-ASF1重组质粒并将其转入野生型四膜虫细胞，通过巴龙霉素筛选，PCR鉴定，ASF1通过同源重组替代MTT1基因，使ASF1在Cd2+诱导下受MTT1启动子调控而过量表达Asf1。过表达ASF1后，免疫荧光定位分析HA-Asf1在四膜虫营养生长期、饥饿期和有性生长期定位于大核、小核以及新形成的大小核中。定位模式与在自身启动子调控下Asf1的定位模式基本一致。过表达ASF1细胞株的大核小核均出现核型变大，并抑制细胞增殖。
　　4.敲减ASF1后导致大核形态异常及小核缺失构建敲除质粒pNeo-ASF1并转入野生型四膜虫细胞，通过巴龙霉素筛选，PCR鉴定，Neo4部分替代ASF1基因。敲减ASF1的细胞株筛选过程出现无小核细胞株，细胞生长抑制，不能进行正常的有性生殖过程和产生有性生殖后代。大核形态异常，部分细胞观察到有大核逐出体的存在。
　　嗜热四膜虫Asf1是进化上保守的功能蛋白，含有保守的功能结构域。特异定位在不同发育阶段的转录活跃的大核和转录沉默的小核中，而在凋亡的大核中信号消失。过表达Asf1导致细胞核增大，而敲减ASF1的细胞株出现小核缺少，大核形态异常。结果表明嗜热四膜虫Asf1不仅参与功能大核和小核染色质的解凝和组装，而且它的正常表达对细胞核的形态和结构维持发挥重要的调控作用。

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第一章 文献综述

1.1 组蛋白分子伴侣Asf1 研究进展

1.2 四膜虫概述

1.3 本课题的研究意义

第二章 嗜热四膜虫中ASF1 基因的鉴定及其序列分析

2.1 前言

2.2 材料

2.3 方法

2.4 结果

2.5 讨论

第三章 嗜热四膜虫中Asf1 亚细胞定位分析

3.1 前言

3.2 材料

3.3 方法

3.4 结果

3.5 讨论

第四章 嗜热四膜虫中Asf1 异常表达影响细胞核稳定性

4.1 前言

4.2 材料

4.3 方法

4.4 结果

4.5 讨论

参考文献

总结与展望

总结

展望

攻读学位期间取得的研究成果

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