双酚A通过整联蛋白β1的致癌机制研究

摘要

双酚A（BPA）是重要的工业原料，以其为原料合成的聚碳酸酯塑料、环氧树脂等材料在生活中被广泛应用。1930年代，BPA被首次报道具有弱的雌激素效应，但因其与雌激素受体结合能力远小于天然雌激素，并未受到人们的关注。上世纪末，BPA被发现可以从其聚合物中泄漏，并通过饮食进入身体影响人们的健康。现在越来越多的证据表明BPA暴露与多种肿瘤的发生、发展密切相关，但其分子机制尚不清楚。 整联蛋白（integrin）是一个细胞粘附因子家族的统称，由至少24种不同的α-β异源二聚体分子组成。它们表达在细胞表面，介导细胞-基质、细胞-细胞之间的粘附，参与细胞增殖、生存、粘附、迁移等生理过程。在所有组成integrin的亚基中，β1亚基是进化上最古老的，也是研究最深入的亚基。Integrinβ1的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关，且往往预示着不良的预后和较低的患者生存率。另外，Integrinβ1有激活型和非激活型两种构象，激活的integrinβ1是细胞迁移的重要媒介，在肿瘤细胞从原发灶向远端转移过程中发挥重要作用。 本研究聚焦于BPA的致癌分子机理研究，利用人结肠正常上皮细胞系NCM460，人结肠癌细胞系DLD1、SW480，通过划痕实验发现环境浓度的BPA可以显著促进细胞的迁移能力。通过Western blotting、实时PCR和抗体功能封闭实验发现该效应是由雌激素受体β起始，并通过integrinβ1的异常高表达介导的；明胶酶谱结果显示，基质金属蛋白酶-9是整个过程的最终效应物。 本研究利用Western blotting、流式细胞术和免疫荧光染色等技术，发现环境浓度的BPA可以迅速激活细胞表面的integrinβ1，并且该激活过程独立于雌激素受体信号通路调控；另两条已知与BPA有关的依赖于GPCR的信号通路也不能完全调控这种效应。进一步，在肝来源的HepG2细胞和宫颈来源的HeLa细胞系中也发现了同样的现象。说明BPA诱导integrinβ1的快速激活效应没有组织或个体特异性。 为了研究BPA快速激活细胞表面的integrinβ1是否由两者的相互作用引起，在大肠杆菌中表达了integrinβ1的胞外区，经过Ni2+亲合层析和梯度透析，得到了纯度>98%的重组截短型integrinβ1蛋白。通过Western blotting、圆二色光谱和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，证明了该重组蛋白具有天然integrinβ1胞外区的构象和功能。借助此重组蛋白，本研究通过荧光光谱和圆二色光谱等技术，证明了BPA和integrinβ1胞外区发生了强烈的相互作用。 为了研究integrinβ1中与BPA相互作用的关键氨基酸残基，通过计算机分子模拟对接和点突变技术，构建、表达并纯化了重组integrinβ1胞外区的两个突变体。实验通过荧光光谱、圆二色光谱以及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术，证明了integrinβ1上的S134/D137和E229即是介导BPA与其相互作用的关键氨基酸残基。 本研究发现环境浓度的BPA暴露可以通过雌激素信号通路诱导integrinβ1异常高表达，进而促进细胞的迁移；高表达的integrinβ1一旦被转运到细胞膜上，与细胞外界的BPA接触即可通过直接的相互作用被BPA激活，进一步促进细胞的迁移过程。实验结果不仅为揭示BPA致癌的分子机制提供了一定的参考，而且突破了传统的围绕雌激素受体的BPA毒理学研究思路，为深入研究BPA的生物学效应开辟了新的途径。

目录

第一章 文献综述

1 引言

2 BPA及其生物学活性研究现状

2.1 BPA应用概述

2.2 人类的BPA暴露途径

2.3 BPA的代谢动力学

2.4 BPA对健康的影响

3 Integrin概述

3.1 Integrin的结构

3.2 Integrin的生理功能

3.3 Integrin的激活

3.4 Integrin与肿瘤

4 本课题的研究意义及研究内容

第二章 BPA通过上调integrinβ1促进NCM460细胞迁移

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料、仪器及试剂

2.2 细胞培养

2.3 MTT细胞活力实验

2.4 划痕实验

2.5 Western blotting

2.6 总RNA的提取及实时PCR

2.7 明胶酶谱

2.8 粘附实验

2.9 Transwell实验

3 实验结果

3.1 环境浓度的BPA暴露促进NCM460细胞迁移

3.2 Integrinβ1在BPA促细胞迁移效应中起关键作用

3.3 ERβ参与了BPA促细胞迁移效应

3.4 环境浓度的BPA暴露不影响细胞粘附

3.5 MMP-9是BPA促细胞迁移的效应物

4 讨论

5 小结

第三章 BPA可以迅速激活细胞表面的integrinβ1

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料、仪器及试剂

2.2 细胞培养

2.3 Western blotting

2.4 免疫荧光染色

2.5 流式细胞术

3 实验结果

3.1 BPA可以激活integrinβ1

3.2 BPA对细胞表面integrinβ1的激活

3.3 BPA可以迅速激活细胞表面的integrinβ1

4 讨论

5 小结

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料、仪器及试剂

2.2 细胞培养及cDNA合成

2.3 重组表达质粒的构建

2.4 表达条件优化

2.5 重组蛋白的表达

2.6 包涵体纯化

2.7 包涵体复性

2.8 纯度及活性测定

2.9 Western blotting

2.10 圆二色光谱

2.11 稳定性测试

3 实验结果

3.1 重组质粒的构建

3.2 包涵体的表达、纯化与复性

3.3 生物活性检测

3.4 稳定性测验

4 讨论

5 小结

第五章 BPA通过直接相互作用激活integrinβ1

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验试剂

2.2 软件应用及获得渠道

2.3 荧光与CD检测

2.4 分子对接

2.5 突变体的构建、表达与纯化

2.6 BPA与蛋白相互作用的体外检测

3 实验结果

3.1 BPA与integrinβ1的相互作用

3.2 BPA与integrinβ1相互作用依赖于S134/D137以及E229

4 讨论

5 小结

总结与展望

参考文献

缩略词表

研究成果

致谢

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