两种检疫性粉蚧及其近似种的鉴定技术研究

摘要

新菠萝灰粉蚧DysmicoccusneobrevipesBeardsley和大洋臀纹粉蚧Planococcusminor(Maskell)属于昆虫纲Insecta，半翅目Hemiptera，蚧总科Coccoidea，粉蚧科Pseudococcidae，是我国进境植物检疫性有害生物。由于二者均存在形态近似种，给口岸检疫带来了困难。前者的形态近似种为同属的菠萝灰粉蚧D.brevipes(Cockerell)，后者的形态近似种为同属的柑橘臀纹粉蚧P.citri(Risso)。本文对两种检疫性粉蚧及其形态近似种开展试验，研究形态和分子特征相结合的鉴定技术。
　　研究内容：
　　(1)生物学试验：室内饲养新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧、大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧，观察比较其生物学特性。
　　(2)形态技术研究：对上述粉蚧实验室种群雌性1龄、2龄、3龄若虫及成虫的形态性状特征进行详细的观察、度量、统计、描述及显微形态图绘制，研究新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧，大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧的形态识别鉴定特征。
　　(3)分子技术研究：选择上述粉蚧不同地理种群共110个雌成虫样本材料，基于快速、易于操作的DNA条形码技术，选用4个分子标记(28S,ITS,COI,EF-1α)进行引物筛选、基因扩增及序列分析，确立区分鉴定新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧、大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧的分子标记。
　　研究结果：
　　(1)生物学差异
　　南瓜饲养新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧，成功建立实验室种群，两种粉蚧均有群集的特性，一个世代所需时间约39天。新菠萝灰粉蚧的繁殖力、初孵若虫的成活率及世代存活率都高于菠萝灰粉蚧。
　　柑橘叶片饲养大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧，成功建立实验室种群，两种粉蚧生物学特性相似。
　　(2)形态鉴定特征
　　新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧种间鉴定特征：
　　1龄若虫：眼基部直径长、肛环直径长分别与体长的比值范围；后足爪与足长的比值范围；背面筛状孔存在与否；刺孔群与腹脐存在与否；筛状孔类型。
　　2龄若虫：眼基部直径长、口器长、肛环直径长、背孔直径长分别与体长的比值范围；后足爪与足长的比值范围；触角柄节、第1、2鞭节分别与触角长的比值范围；三格腺背腹面数量差异；筛状孔在腹面的分布范围；筛状孔类型。
　　3龄若虫：气门长与宽的比值范围；后足爪冠毛与足长的比值范围；体毛与体长的比值范围；触角第4鞭节与第5鞭节长的比值范围；三格腺背腹面数量差异；筛状孔类型。
　　雌成虫：气门长与宽的比值范围；后足爪冠毛与足长的比值范围；背毛与体长的比值范围；触角第4鞭节与第5鞭节长的比值范围；多格腺在第7与第8腹节数量差异；领状腺在第3、8腹节存在与否；筛状孔类型。
　　大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧种间鉴定特征：
　　1龄若虫：试验中收集的大洋臀纹粉蚧1龄若虫玻片标本少，无法满足形态特征研究的需要，因此未比较两种粉蚧在该龄期的形态鉴定特征。
　　2龄若虫：气门长与体长的比值范围；三格腺背腹面的数量差异；盘孔及领状腺的分布范围。
　　3龄若虫：触角第1鞭节与触角的比值范围；三格腺背腹面的数量差异；盘孔在背面第6腹节存在与否；领状腺存在与否。
　　雌成虫：三格腺背腹面的数量差异；盘孔在背面胸腹部的数量差异；多格腺及领状腺的分布范围。
　　(3)分子鉴定特征
　　引物：选用引物28S_S3660_F/28S_A335_R,ITS_n44_F/ITS_n55_R,Pco_F/C1-12342_R及EF_scutA_F/EF_rcM52.6_R对四种粉蚧进行PCR扩增，均能获得单一、稳定、清晰的目的条带，且扩增所有测试样品均能成功。
　　测序：对上述粉蚧样品扩增的单一条带进行测序，28S、ITS及COI均成功获得其基因序列。EF-1α基因在新菠萝灰粉蚧、大洋臀纹粉蚧及柑橘臀纹粉蚧中均测序成功，在菠萝灰粉蚧样品中测序失败，因为该基因的PCR产物中存在多个同源拷贝。
　　条形码间隔：种间遗传距离的最小值与种内遗传距离的最大值之差为条形码间隔。新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧在28S、ITS及COI基因区段均存在条形码间隔，其值分别为：2.13％、12.51%及4.50%。
　　大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧在28S、ITS及COI基因区段均存在条形码间隔，其值分别为：0.28%、0.54%及1.69%；在EF-1α基因区段，两种粉蚧存在单倍型共享现象，因此不存在条形码间隔。
　　NJ系统发育树：新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧的28S、ITS、COI基因序列矩阵构建的NJ树均显示两种粉蚧以高置信度(89%-100%)各自形成独立分支。
　　大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧的ITS、COI基因序列矩阵构建的NJ树均显示两种粉蚧以高置信度(99%-100%)各自形成独立分支。28S、EF-1α基因序列矩阵构建的聚类树支持率低于70%。
　　结论：区分新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧的分子标记为：COI(长度约为750bp)，ITS(长度约为1300bp)和28S基因区段(长度约为750bp)。区分大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧的分子标记为：COI(长度约为750bp)和ITS(长度约为1300bp)。

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第一章 前言

1.1 检疫性粉蚧新菠萝灰粉蚧与其形态近似种菠萝灰粉蚧概述

1.2 检疫性粉蚧大洋臀纹粉蚧与其近似种柑橘臀纹粉蚧概述

1.3 蚧虫鉴定分子概述

1.4 本研究的内容及意义

第二章 两种检疫性粉蚧与其近似种的识别鉴定—基于不同发育期形态特征

2.1 材料与方法

2.1.1 供试粉蚧的饲养与收集

2.1.2 主要仪器和试剂

2.1.3显微玻片标本的制作程序

2.1.4形态特征选取、测量及统计

2.1.5 显微形态图绘制

2.2 结果与分析

2.2.1 新菠萝灰粉蚧生物学特性及雌性各龄期形态特征

2.2.2 菠萝灰粉蚧生物学特性及雌性各龄期形态特征

2.2.3新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧雌性形态特征比较

2.2.4 大洋臀纹粉蚧生物学特性及雌性各龄期形态特征

2.2.5 柑橘臀纹粉蚧生物学特性及雌性各龄期形态特征

2.2.6大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧雌性形态特征比较

2.3 讨论

第三章 两种检疫性粉蚧与其近似种的识别鉴定—基于DNA分子标记

3.1 材料与方法

3.1.1 粉蚧的搜集与保存

3.1.2 主要仪器与试剂

3.1.3 基因组提取及浓度测定

3.1.4 PCR扩增条件的优化及序列测定

3.1.5 基因序列分析

3.2 结果与分析

3.2.1 基因组提取结果

3.2.2 PCR扩增及序列测定结果

3.2.3 NCBI数据库比对结果

3.2.4 各基因单倍型分析结果

3.2.5 DNA条形码间隔检测结果

3.2.6 系统发育树分析结果

3.3 讨论

第四章 总结

4.1 新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧种间识别鉴定特征

4.2 大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧种间识别鉴定特征

参考文献

攻读硕士学位期间的研究成果

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