鉴定或辅助鉴定山羊草属中检疫性杂草和非检疫性杂草的方法

摘要

本发明提供鉴定或辅助鉴定山羊草属中检疫性杂草和非检疫性杂草的方法，涉及生物技术领域。所述方法，包括：提取待鉴定山羊草属杂草总DNA；以所述总DNA为模板，采用引物matK？F和matK？R扩增matK基因片段；将扩增得到的matK基因片段，采用限制性内切酶HypCH4Ⅲ进行酶切，若酶切产物中有长度为210-250bp和80-120bp的两条酶切片段，所述杂草为山羊草属中国禁止进境的检疫性杂草；若酶切产物中有长度为310-350bp的酶切片段，所述杂草为山羊草属中非检疫性杂草。本发明方法，能够从分子水平上快速、准确地鉴定出山羊草属检疫性杂草，且操作简单。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及鉴定或辅助鉴定山羊草属中中国禁止进境的检疫性杂草和非检疫性杂草的方法。

背景技术

山羊草属(AegilopsLinn.)为禾本目(Graminales)禾本科(Gramineae)一年生草本植物，多数分布于地中海沿岸或中亚。本属中的具节山羊草(Aegilopscylindrical)与节节麦(Aegilopstauschii)是农田恶性杂草，其与小麦亲缘关系较近，在苗期难以区分和防除，其种子比小麦成熟早，易落粒，因此已成为小麦连作田难以防治的恶性杂草。

具节山羊草与节节麦仅在我国局部地区有分布，且在我国政府管控之下。为了预防这两种杂草传入我国并扩散，中华人民共和国农业部在2007年发布第862号公告，将具节山羊草和节节麦列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

我国出入境检验检疫部门多次在进口的粮谷中检出具节山羊草和节节麦。由于具节山羊草和节节麦多以果实或种子形态混杂在进口粮谷中，其果实和种子与同属近似种在形态上很难区分，在进口粮谷中检出山羊草属杂草时，无法确定其是否为我国禁止进境的检疫性杂草，给检疫鉴定工作带来了很大困难。

目前，具节山羊草和节节麦这两种检疫性杂草的鉴定仍然依靠形态学方法，准确率较低，耗时较长，且需要鉴定人员具备丰富的植物分类学知识和经验。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定或辅助鉴定山羊草属中检疫性杂草和非检疫性杂草的方法，该方法能够从分子水平上快速、准确地鉴定出山羊草属检疫性杂草，且操作简单。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

一种鉴定或辅助鉴定山羊草属中检疫性杂草和非检疫性杂草的方法，包括以下步骤：

(1)提取待鉴定山羊草属杂草总DNA；

(2)以所述总DNA为模板，采用引物matKF和matKR扩增matK基因片段，其中matKF序列如SEQIDNO:1所示，matKR序列如SEQIDNO:2所示；

(3)将扩增得到的matK基因片段，采用限制性内切酶HypCH4Ⅲ进行酶切，若酶切产物中有长度为210-250bp和80-120bp的两条酶切片段，所述杂草为山羊草属中中国禁止进境的检疫性杂草；若酶切产物中有长度为310-350bp的酶切片段，所述杂草为山羊草属中非检疫性杂草。

在本发明中，所述山羊草属(AegilopsLinn.)中中国禁止进境的检疫性杂草为具节山羊草和节节麦，非检疫性杂草为双角山羊草、欧山羊草、小亚山羊草、顶芒山羊草、肥山羊草、牡山羊草、粘果山羊草、沙融山羊草、拟斯卑尔托山羊草、钩刺山羊草、小伞山羊草、偏凸山羊草、异变山羊草和粘果山羊草。

优选的技术方案中，扩增matK基因片段的PCR反应体系为：ddH₂O18.25μL，10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs1μL，浓度为20μM的matKF1μL，浓度为20μM的matKR1μL，5U/μL的TaqDNA聚合酶0.25μL，100ng/μL待鉴定山羊草属杂草总DNA1μL。

优选的技术方案中，所述PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

优选的技术方案中，采用限制性内切酶HypCH4Ⅲ进行酶切的反应体系为：matK基因片段PCR产物10μL，ddH₂O18μL，10U/μL限制性内切酶HypCH4III2μL，10×Buffertango2μL；反应条件为65℃酶切反应6h。

有益效果：

(1)本发明鉴定方法与传统的形态学鉴定相比，不受个体发育阶段、成熟度及完整度影响，能够从分子水平上快速、准确鉴定山羊草属中中国禁止进境的检疫性杂草和非检疫性杂草。

(2)本发明鉴定方法降低了鉴定的技术门槛，鉴定者无需分类学专业知识，只要掌握基本的PCR实验技术即可。

(3)本发明鉴定方法操作简单，无需克隆、测序，既经济便宜又节省时间。

附图说明

图1各样品酶切产物的电泳图，其中1具节山羊草；2双角山羊草；3欧山羊草；4小亚山羊草；5顶芒山羊草；6肥山羊草；7牡山羊草；8粘果山羊草；9节节麦；10沙融山羊草；11拟斯卑尔托山羊草；12钩刺山羊草；13小伞山羊草；14偏凸山羊草；15异变山羊草；16粘果山羊草。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本发明进行下一步详细描述。

1)提取山羊草属杂草总DNA

待鉴定杂草C20141215001和C20141215002通过形态学进行分类鉴定为山羊草属(AegilopsLinn.)节节麦(Aegilopstauschii)和具节山羊草(Aegilopscylindrical)，但是，形态鉴定要求这两种杂草的果实完整，且需要具有经验的分类学专家才可以准确鉴定。

采用QIAGEN的DNeasyPLANTMINIKIT试剂盒提取待鉴定杂草的总DNA，材料可以选择待鉴定杂草的任何部位，包括叶片、果实、种子等。另选已经采用形态学方法鉴定为山羊草属(AegilopsLinn.)中非检疫性杂草的样品作为对照杂草，采用相同方法提取各对照杂草的总DNA。待鉴定杂草和对照杂草的具体信息如表1所示。

表1用于检测的山羊草属物种

2)PCR扩增

以各样品的总DNA为模板，采用引物matKF(SEQIDNO:1)和matKR(SEQIDNO:2)扩增各样品的matK基因片段(叶绿体成熟酶基因片段)，其中matKF序列为：5’-GCATTTATTGCGATTCTTTC-3’，matKR序列为：5’-GAATTGCCTTTCCTTGATA-3’。

PCR反应体系如下：ddH₂O18.25μL，10×PCRBuffer(含有Mg²⁺)2.5μL，dNTPS1μL(2.5mMeach)，浓度为20μM的matKF1μL，浓度为20μM的matKR1μL，5U/μL的TaqDNA聚合酶0.25μL(5U/μL)，100ng/μL待鉴定山羊草属杂草总DNA1μL。PCR反应中的试剂购自TakaRa公司。

PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

ddH₂O为双蒸水,是以去离子水经过两次蒸馏后得到双蒸水。

3)酶切反应

吸取各样品的PCR产物10μL放置于0.2mLPCR离心管，使用限制性内切酶HypCH4III(ThermoScientific)进行酶切反应。酶切反应体系由以下成分组成：PCR产物10μL，ddH₂O18μL，10U/μL限制性内切酶HypCH4III2μL，10×Buffertango(含有牛血清白蛋白，购自ThermoScientific)2μL。反应体系配置完毕后充分震荡混匀离心，放置于65℃水浴锅中酶切反应6h，然后加入2μL0.5M的EDTA(pH＝8)终止酶切反应。

4)电泳图谱

取各样品的酶切产物10μL采用2％(g/mL)浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，150V稳定电压下电泳，DNA分子梯度标记选择2000bpMarker，电泳液为1倍TAE(常规配方)，电泳时间为30分钟。电泳结束后，于0.1％的EB溶液中染色20min，之后在凝胶成像系统下观察酶切图谱。

5)结果判定

如图1所示，1和9泳道分别为山羊草属中具节山羊草和节节麦matK基因片段酶切产物，出现长度为232bp和99bp两条带。其它泳道为山羊草属中非检疫性杂草，只出现一条长度为331bp的条带。上述结果说明，本发明鉴定方法能够快速准确鉴定山羊草属中中国禁止进境的检疫性杂草和非检疫性杂草。

SEQUENCELISTING

<110>江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

<120>鉴定或辅助鉴定山羊草属中检疫性杂草和非检疫性杂草的方法

<130>20150804

<160>2

<170>PatentInversion3.3

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<213>artificial

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<223>matKR

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