核桃举肢蛾病原真菌BXY01菌株的分离鉴定及致病力研究

摘要

核桃举肢蛾（AtrijuglanshetaoheiYang）属鳞翅目Lepidoptera，举肢蛾科Heliodinidae，是一种专门蛀食核桃果实的害虫。它以幼虫蛀入果内危害果皮和核桃种子，使核桃的果皮变黑，果实干缩，经济损失巨大。目前，防治核桃举肢蛾以树冠喷洒化学农药防治成虫、卵和初孵化的幼虫，但是对蛀入核桃果内的幼虫起不到防治作用。而且化学农药有污染、残留等问题。根据核桃举肢蛾老熟幼虫入土结茧越冬的习性，本研究展开以入土幼虫为靶标，利用昆虫病原真菌在表土层中感染幼虫，进行生物防治的研究。
　　研究内容：
　　（1）在山西盂县设立核桃实验林地，调查核桃举肢蛾越冬幼虫的虫口密度，观察核桃果实内幼虫的发育进度和危害状况，并对幼虫干尸的化学成分进行分析，测定其蛋白质、脂肪、几丁质及氨基酸的含量。为利用病原真菌提供依据。
　　（2）从自然染病的核桃举肢蛾幼虫上分离获得一株病原真菌，对该菌株进行回接杀虫实验，形态特征观察和分子鉴定。
　　（3）比较分离得到的菌株与来自不同寄主昆虫的球孢白僵菌3菌株对核桃举肢蛾的致病力。
　　（4）对分离获得的病原菌株作了生物学特性和野外宿存试验。
　　研究结果：
　　1.核桃举肢蛾越冬虫口密度调查，幼虫果内发育和危害观察及幼虫干尸化学成分测定
　　1.1.越冬虫口密度和幼虫特征：调查显示，在3、4月份，核桃举肢蛾越冬幼虫在土壤内的密度为78-102头/m2，其中活茧为9-18头/m2，茧内的越冬幼虫，头部黄褐色，虫体为白色，体长5-7mm。自然染病的幼虫为1-1.5头/m2。
　　1.2.幼虫在果实内的发育与危害：将虫害核桃解剖镜检，发现在危害初期，核桃果皮仍然保持青绿，幼虫钻蛀的虫孔和坑道都比较细小；危害中期，果实青皮上出现黑色斑块，虫体长大，果肉被大量蛀食，形成纵横交错的黑色坑道，内有虫粪；危害后期，核桃果皮大部分变黑，大部分果肉已被蛀食，形成许多虫孔和坑道，并充满大量虫粪；危害末期，幼虫发育接近成熟，果皮完全变黑，果肉几乎被完全蛀食，只剩下大量的虫粪。在钻蛀的核桃内幼虫平均6-7头，多的达13头。幼虫老熟后钻出核桃入土，刚脱果的幼虫体长6-9mm；头部黄褐色，虫体色浅，淡红，腹部末端2节呈白色。
　　1.3.幼虫干尸化学成分：经测定，幼虫干尸中蛋白质、脂肪和几丁质的含量分别为51g/100g，28g/100g和21g/100g。17种氨基酸总含量为47.24g/100g，其中以谷氨酰胺、天冬氨酸含量较多，分别为6.02g和5.17g。
　　2.核桃举肢蛾病原真菌BXY01菌株的分离纯化与鉴定
　　在越冬虫茧中自然染病的幼虫虫尸上，发现有虫生真菌寄生。染病虫体僵硬，表面有白色菌丝。从中分离获得一株病原真菌BXY01。作回接杀虫试验，其感染症状与自然染病虫尸的症状相同，证明该菌株是核桃举肢蛾的病原真菌。
　　培养后观察，该菌株的菌落为绒毛状，菌丝致密，边缘整齐，菌落背面初期白色，后期淡黄色。菌丝白色，呈“之”字形弯曲生长产孢，根据形态学特征，鉴定该菌株为白僵菌属的球孢白僵菌。采用分子鉴定技术，将获得该菌株的ITS区域序列，提交至GenBank，获得AccessionNo.KU214583，经比对分析，BXY01菌株与GenBank中Beauveriabassiana(AccessionNo.JN379794、No.JN379807、No.JN379808)同源性均为99％。结合形态学和分子鉴定结果，确定分离的BXY01菌株为白僵菌属的球孢白僵菌Beauveriabassiana。
　　3.比较BXY01菌株与球孢白僵菌其他3个菌株对核桃举肢蛾的致病力
　　选用球孢白僵菌3菌株，FDB01（原寄主为红松帕克阿扁叶蜂）、TST05（原寄主为桃小食心虫）、SYN01（原寄主为松毛虫），与分离得到的BXY01菌株制备孢子悬浮液（浓度为1×108孢子/mL）对核桃举肢蛾幼虫进行感染试验。结果显示，核桃举肢蛾第8d的校正致死率分别为87.8±5.2%、84.4±4.5%、91.1±2.4%和93.3±4.3%。致死中时分别为4.743d、4.934d、4.098d和3.760d，说明4个菌株对核桃举肢蛾幼虫都有较高的致死率，较短的致死中时，其中以BXY01为最优。
　　BXY01菌株5个浓度孢子悬浮液（1×109孢子/mL、5×108孢子/mL、1×108孢子/mL、5×107孢子/mL、1×107孢子/mL）对核桃举肢蛾幼虫感染后第8d的校正致死率依次为100%、95.56±4.2%、93.3±4.3%、85.7±12.3%和76.7±7.2%。致死中时依次为3.253d、3.519d、3.760d、4.270d和4.843d。说明该菌株对核桃举肢蛾幼虫的致死率和致死中时具有浓度效应。
　　4.BXY01菌株的生物学特性和在野外土壤中的宿存
　　4.1.生物学特性：试验证明，BXY01菌株温度适应范围较广，在15℃到35℃间都能够生长，产孢和萌发，其中在25℃下菌落生长直径、产孢量、孢子萌发率都最高。培养7d，菌落直径3.87±0.03cm，产孢量11.48±0.81×107孢子/mL，孢子萌发率67.5±4.5%。经紫外线照射（30min）后，菌落生长直径、产孢量、孢子萌发率比对照组均有所降低，但差异未达到显著水平。说明该菌株具有一定的抗紫外能力。
　　4.2.菌在土壤中的宿存情况：9月份在土壤中施用球孢白僵菌后(102.38±6.29×104CFU/g)，逐月检查在0cm、5cm、10cm和15cm深度土壤中菌的宿存数量（以成菌落数计），结果显示，10月份为27.76±1.89×104、42.04±3.21×104、35.44±2.16×104和21.97±2.13×104CFU/g；11月份为8.35±1.35×104、19.10±1.53×104、14.31±1.80×104和11.11±1.83×104CFU/g。12月份为1.22±0.25×104、8.27±1.01×104、5.89±0.93×104和3.50±0.57×104CFU/g。到次年2月份，为0.42±0.16×104CFU/g、4.36±0.33×104、4.75±0.57×104和3.74±0.34×104CFU/g。3月份为0.1±0.07×104、4.37±0.36×104、4.63±0.51×104和3.72±0.58×104CFU/g。由此可见，菌的宿存数量呈持续下降趋势，9月-11月菌宿存数量的下降明显，12月份-3月份菌的宿存数量在一定范围内波动，土壤层5-10cm较0cm和15cm处的菌的宿存数量较多，说明5-10cm的土壤层温湿度相对稳定，更适宜菌的宿存，而核桃举肢蛾幼虫越冬也主要集中在此范围，为利用真菌防治提供了良好的条件。

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第一章 前言

1.1 核桃举肢蛾的危害与防治

1.2 白僵菌的研究现状及其应用

1.3 本文研究的内容、目的及意义

第二章 核桃举肢蛾虫口密度调查、果内幼虫发育和危害观察以及幼虫干尸化学成分测定

2.1 材料和方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 BXY01菌株的分离纯化及种属地位鉴定

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 BXY01菌株与球孢白僵菌3菌株对核桃举肢蛾幼虫致病力的比较

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章 BXY01菌株的生物学特性及野外宿存

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

第六章 总 结

主要研究成果

本研究的创新之处：

参考文献

攻读硕士学位期间的研究成果

致谢

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