基于ITS及ndhF-rpl32序列的荞麦多样性研究

摘要

荞麦（Buckwheat）是蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill）的双子叶植物，由于其全面的营养成分和药用价值，使得荞麦的产品、制品已经深入到人们的日常生活。荞麦作为一种小宗作物，目前在我国已命名的荞麦共有23个种，其中，仅甜荞和苦荞两个为栽培种，其余均为野生种，这些野生种大多分布在我国的西南地区。本研究基于核基因组中的ITS序列及叶绿体中的ndhF-rpl32序列对从我国西南地区收集到的10个（亚、变）种及1个栽培苦荞的变型共71份材料的遗传多样性进行研究，主要结果如下：
　　1.荞麦 ITS和 ndhF-rpl32序列的特征：在 ITS序列中，变异主要发生在 ITS1区和 ITS2区，其信息位点所占比率分别为38.5％和43%，而5.8S的信息位点仅占10.3%；在ndhF-rpl32序列中，信息位点占19.6%。由此可见，5.8S rDNA比较保守，其次为ndhF-rpl32序列，ITS1和ITS2的变异程度较高。
　　2.依据ITS和ndhF-rpl32序列构建的系统发育树：本研究通过2种不同的算法来构建系统发育树，分别为邻接法和最大简约法，采用邻接法构建的2个系统发育树都能将71份荞麦材料分为大粒组和小粒组两个类群，其中，大粒组类群包括栽培苦荞、米苦荞、野生甜荞、栽培甜荞、金荞复合物。小粒种类群包括齿翅野荞、疏穗小野荞、小野荞、密毛野荞、细柄野荞和硬枝万年荞。在大粒组类群中，金荞复合物、栽培苦荞(包括米苦荞)、栽培甜荞(包括野生甜荞)又聚为三支；在小粒组类群中，疏穗小野荞可独自形成一个分支，齿翅野荞、小野荞、密毛野荞和细柄野荞聚为一支。最大简约法构建的系统发育树中，金荞复合物、栽培甜荞（包括野生甜荞）、栽培苦荞（包括米苦荞）、疏穗小野荞均可以单独聚为一支，但并不像邻接法能将71份材料分为两大类群。两个方法构建系统发育树各有优势，邻接法适用于遗传距离较小，信息位点比例小的短序列；最大简约法适用于进化速率相近，同时信息位点比例高的长序列。
　　3.荞麦属植物的种间亲缘关系：在ITS和ndhF-rpl32序列中，无论是采用邻接法还是最大简约法，结果都显示，栽培苦荞和金荞复合物之间的亲缘关系较栽培甜荞与金荞复合物之间的亲缘关系更近。小粒组中的齿翅野荞、小野荞、密毛野荞和细柄野荞这四个种的亲缘关系较近，这与它们在形态学上的表现一致。在大粒组中，栽培苦荞的变异完全覆盖了米苦荞，这与米苦荞仅是栽培苦荞的一个变异类型相符合；同时野生甜荞与栽培甜荞的亲缘关系较近。
　　4.大粒组荞麦ITS2序列的SNP位点分析：从GenBank中下载了21条大粒组荞麦的ITS2序列，并与收集到的26份大粒组荞麦的ITS2序列共同分析，发现存在稳定的SNP位点，可用于金荞复合物、甜荞（含栽培甜荞和野生甜荞）和栽培苦荞的鉴定。

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第一章 文献综述

1.1 荞麦简介

1.1.1 荞麦的营养价值、药用价值和文化价值

1.1.2 荞麦在食品加工中的应用

1.1.3 荞麦的起源及其分类

1.2 遗传多样性理论与方法在荞麦属中的应用

1.2.1 形态学研究

1.2.2 细胞学研究

1.2.3 生化标记

1.2.4 DNA标记

1.3 DNA序列分析在遗传多样性研究中的应用

1.3.1 编码核糖体RNA的基因及其间隔区的应用

1.3.2 叶绿体基因组序列的应用

1.3.3 DNA序列分析在荞麦遗传多样性中的应用

1.4 本研究目的与意义

第二章 基于ITS与ndhF-rpl32分析荞麦种间亲缘关系

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 DNA提取

2.2.2 ITS与ndhF-rpl32序列扩增

2.2.3 PCR产物回收纯化

2.2.4纯化产物与载体的连接

2.2.5连接产物的转化

2.2.6 序列比对和分析

2.3 实验结果

2.3.1 DNA提取结果

2.3.2 ITS及ndhF-rpl32扩增结果

2.3.3 研究材料的ITS序列特点

2.3.4 基于ITS序列分析荞麦遗传距离

2.3.5 基于ITS序列构建系统发育树

2.3.6 研究材料的ndhF-rpl32序列特点

2.3.7 基于ndhF-rpl32序列分析荞麦遗传距离

2.3.8 基于ndhF-rpl32序列构建系统发育树

2.4 讨论

2.4.1 ITS和ndhF-rpl32序列在荞麦系统进化研究中的应用

2.4.2 基于ITS和ndhF-rpl32序列的荞麦物种亲缘关系分析

2.4.3 基于ITS和ndhF-rpl32序列的荞麦植物多样性分析

2.4.4 两种构建系统发育树方法的比较

2.4.5 疏穗小野荞、小野荞与硬枝万年荞的亲缘关系

第三章 荞麦大粒组ITS2序列的SNP位点分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 栽培苦荞、栽培甜荞、野生甜荞和金荞复合物的ITS2序列

3.3.2 基于ITS2序列计算的遗传距离

3.3.3 基于ITS2序列构建的系统发育树

3.3.4 ITS2序列SNP位点分析

3.4 讨论

3.4.1 ITS2序列与ITS序列的比较

3.4.2 SNP准确鉴定栽培苦荞、甜荞与金荞复合物

全文小结

参考文献

附录：熟化工艺对黑豆花青素含量的影响

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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