蝎毒多肽提取物联合5-氟尿嘧啶对H22肝癌抑制作用的实验研究

摘要

目的:
　　 观察蝎毒多肽提取物(PESV)联合5-氟尿嘧啶(5-Fu)对H22肝癌的生长、微血管密度及NF-κ Bp65、MMP-9和VEGF表达的影响，进一步揭示PESV抗癌的作用机制，以为其辅助传统化疗药物用于临床抗肿瘤治疗提供理论依据。
　　 方法:
　　 1.建立小鼠H22肝癌皮下荷瘤模型，随机分为荷瘤对照组、PESV组、化疗组（即5-Fu组）和联合组（即PESV+5-Fu组），每组10只，连续干预21天。隔日测量肿瘤体积，绘制肿瘤体积增长曲线并计算抑瘤率，观察PESV联合5-Fu对H22肝癌移植瘤生长的抑制作用。
　　 2.常规HE染色，光镜下观察H22肝癌组织病理学改变。
　　 3.CD34标记肿瘤微血管，检测H22肝癌组织微血管密度(MVD)，观察PESV联合5-Fu对H22肝癌血管生成的影响。
　　 4.免疫组织化学和Western blot法检测H22肝癌组织NF-κBp65、MMP-9和VEGF蛋白表达水平。
　　 5.RT-PCR法检测H22肝癌组织NF-κ Bp65、MMP-9和VEGF mRNA表达水平。
　　 结果:
　　 1.PESV联合5-Fu对小鼠H22肝癌移植瘤生长的影响
　　 药物干预后，PESV组、化疗组和联合组小鼠H22肝癌移植瘤体积增长速度较荷瘤对照组均明显减慢，瘤重亦显著降低，抑瘤率分别为18.98％、25.59％、44.24％，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）;与化疗组比较，联合组的瘤重和肿瘤体积亦均存在显著差异(P＜0.05)。
　　 2.各组肿瘤组织的病理学变化
　　 HE染色显示，联合组可见大面积坏死区，较多肿瘤细胞呈细胞核碎裂、核固缩等凋亡和坏死的形态学改变;荷瘤对照组坏死区较少，且坏死面积较小，肿瘤细胞生长旺盛，坏死及凋亡细胞较少;PESV组和化疗组亦有明显坏死，但坏死程度较联合作用组明显减轻。
　　 3、.PESV联合5-Fu对H22肝癌组织新生血管形成的影响
　　 与荷瘤对照组比较，联合组MVD明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，化疗组MVD亦降低(P＜0.05);与PESV组和化疗组比较，联合组MVD亦明显降低(P＜0.01)。
　　 4、PESV联合5-Fu对H22肝癌组织NF-κBp65、MMP-9和VEGF蛋白表达的影响
　　 免疫组织化学法检测结果显示，与荷瘤对照组比较，联合组NF-κB p65、MMP-9和VEGF表达量均显著减少(P＜0.01);与化疗组比较，联合组NF-κB p65、MMP-9和VEGF表达量亦明显减少(P＜0.01);相关分析得出，NF-κB p65、MMP-9和VEGF的蛋白表达量均与MVD成正相关(P＜0.01); NF-κB p65和MMP-9、NF-κBp65和VEGF、MMP-9和VEGF之间的蛋白表达量亦存在显著正相关(P＜0.01)。Western blot法检测结果与免疫组织化学法结果基本一致。
　　 5、PESV联合5-Fu对H22肝癌组织NF-κ Bp65、MMP-9和VEGF mRNA表达水平的影响
　　 RT-PCR法检测结果显示，与荷瘤对照组和化疗组比较，联合组NF-κB p65、MMP-9和VEGF mRNA表达均明显减少(P＜0.01); NF-κB p65和MMP-9、NF-κBp65和VEGF、MMP-9和VEGF之间的mRNA表达量均存在显著正相关(P＜0.01)。
　　 结论:
　　 1.PESV联合5-Fu可明显抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生长及新生血管形成;
　　 2.PESV联合5-Fu可抑制NF-κ Bp65、MMP-9和VEGF转录和蛋白表达，这可能是PESV联合5-Fu抑制H22肝癌生长和血管生成的机制之一。

目录

声明

摘要

主要符号表

前言

材料和方法

1．1 实验材料

1．2 蝎毒多肽提取物的提取方法和质量标准

1．3 种植小鼠H22肝癌皮下移植瘤及药物干预

1．4 记录小鼠H22肝癌皮下移植瘤体积和瘤重变化

1．5 HE染色法观察肿瘤组织病理学变化

1．6 免疫组织化学SP法检测H22肝癌肿瘤组织MCD及NF-κBp65、MMP-9和VEGF蛋白表达

1．7 H22肝癌组织总蛋白的提取及浓度测定

1．8 Western blot法检测H22肝癌组织NF-κBp65、MMP-9和VEGF蛋白表达水平

1．9 H22肝癌组织总RNA的提取及浓度测定

1．10 RT-PCR法检测H22肝癌组织NF-κBp65、MMP-9和VEGFmRNA表达水平

1．11 统计学方法

结果

2．1 PESV联合5-Fu对H22肝癌移植瘤生长的抑制作用

2．2 各组肿瘤组织病理学变化

2．3 PESV联合5-Fu对H22肝癌组织微血管密度的影响

2．4 PESV联合5-Fu对H22肝癌组织NF-κBp65、MMP-9和VEGF蛋白表达的影响

2．5 PESV联合5-Fu对H22肝癌组织中NF-κBp65、MMP-9和VEGFmRNA表达水平的影响

讨论

结论

参考文献

附图

综述 血管生成素-2与肿瘤血管生成的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢