汾河太原河段水华藻及生物源物质抑藻机理研究

摘要

淡水水体的富营养化和气候变暖引起的有害蓝藻水华已经成为了全球严重的环境问题之一。蓝藻水华可导致一系列水环境问题的发生，如降低水体溶解氧，影响水产养殖业、饮用水供应及休闲娱乐用水。最严重的是，有害蓝藻水华产生的次生代谢物（藻毒素和藻源异味物质等）对水生生物、牲畜及人类有极大的危害。山西省水资源严重匮乏，省内河流屈指可数，其中最大且最长的河流是汾河。在维持山西生态环境、经济发展和居民生活中起着不可估量的作用。汾河太原河段处于汾河流域的中段。随着工业发展和城市人口的迅速膨胀，水体富营养化日益严重，导致水质开始恶化。2011年8月，汾河太原段暴发了大规模的蓝藻水华，被污染的水域长达数公里，其后每年都会发生不等面积的水华。因此，控制藻类的大量生长和繁殖，消除频繁出现的有害蓝藻水华，成为了一个亟待解决的环境问题。2012-2016年，本课题组对汾河太原段水体中的浮游植物及水华优势种进行了鉴定，首次发现产藻毒素和藻源异味物质种类。为了控制水华，研究了环境友好型的控藻方法及抑藻机理，主要的研究结果如下:
　　(1)2012-2016年，通过对采集样品的观察，共鉴定出浮游植物202种，隶属于7门72属，区系组成主要以绿藻、硅藻和蓝藻为主。随着季节和年份的变化，浮游植物物种总数呈现上升的趋势，尤其是蓝藻、绿藻和硅藻。每年采集的样品中都会发现新出现的物种，并且数量也在不断上升。汾河太原河段浮游植物细胞密度呈现高度的时空异质性，并且在年内各个季度分配不均，5月份汾河太原河段10个采样点的浮游植物平均细胞密度为68.85×106-74.00×106cells L-1，7月份浮游植物平均细胞密度为194.57×106-226.70×106cells L-1和10月份浮游植物平均细胞密度为45.63×106-63.00×106cells L-1。随着年份的变化，藻类的细胞密度呈现上升的趋势，并且蓝藻以绝对优势呈现上升的趋势。这5年中，10个采样点共发现浮游植物优势种6门19种。其中蓝藻门种类占42.11％，其次为绿藻门种类，占21.05％，其它门优势种类相对较少。但是每年的5月份，跻汾桥和南中环桥段都会出现裸藻水华，而每年的7-9月份，各采样点都会出现面积不等的微囊藻水华，并且是不同种的微囊藻形成优势种。各采样点的优势种呈现高度的时空异质性，并且在年内各个季度变化较大。通过形态和分子生物学结合的手段，对发生水华的优势种进行了鉴定，结果表明，5月份发生的裸藻水华，优势种为血红裸藻（Euglena sanguinea）。而7-9月份发生的微囊藻水华，优势种为铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、挪氏微囊藻（Microcystis novacekii）和惠氏微囊藻(Microcystis wesenbergii)。
　　(2)本研究首次发现汾河太原河段水体中的微囊藻产毒素和异味物质。分离纯化得到的8株微囊藻中有5株含有微囊藻毒素合成相关基因mcyA、mcyD和mcyE，且均为产毒微囊藻，但是其产毒素浓度较低。TY001、FH0003、FH0004、FH0006和FH0007产毒素浓度分别为59.76±5.32、36.54±3.06、39.19±2.09、32.09±2.08和36.46±3.02pg/108cells。分离纯化的微囊藻挥发性异味物质的检测结果表明，8株微囊藻中有6株（TY001、FH0002、FH0003、FH0004、FH0005和FH0006）可产生明显的异味。经过嗅味判断及与常见异味种类标准品的比对，确定这6株微囊藻产生的异味物质主要为β-环柠檬醛(β-cyclocitral)，其他三类淡水水体常见的藻源异味物质(Geosmin，2-MIB和β-紫罗兰酮)均未检出。
　　(3)连苯三酚同其它化感物质一样，对铜绿微囊藻生长有一定的抑制作用。首先，藻胆体降解相关基因nblA表达量的上升可能引起PBS降解蛋白的增加，导致光合效率下降。其次，Fv/Fm、PIABS和PICS等叶绿素荧光参数的显著降低，综合说明铜绿微囊藻完整的光合作用性能受到了破坏。同时，也表明连苯三酚对铜绿微囊藻的光合抑制是极其重要的机理。连苯三酚可以明显抑制细胞生长甚至使细胞致死，是能有效控制和消除铜绿微囊藻水华的化感物质。更进一步的研究中，探索更多的化感抑制机理，寻求更高效的化感抑藻物质来控制有害蓝藻水华。
　　(4)连苯三酚可明显上调铜绿微囊藻TY001的氧化胁迫应答相关基因prx、ftsH、grpE和fabZ，DNA修复相关基因recA和gyrB的相对表达量。同时，氧化胁迫明显提高了细胞内3种关键的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)含量，ROS的大量增加引起脂质过氧化反应发生，从而导致丙二醛(MDA)含量上升。这些实验结果表明，连苯三酚对铜绿微囊藻TY001有明显的抑制作用，氧化损伤和DNA损伤是重要的致毒机理。更重要提出的是，微囊藻毒素合成基因（mcyB和mcyD）和氮吸收相关基因（ntcA）的表达量及微囊藻含量明显提高。进一步的研究中需要发现更多的化感物质和更加深入的抑藻机理，控制和消除有害蓝藻水华。
　　(5)5，4'-二羟基黄酮(5，4'-dihydroxyflavone，5，4'-DHF)对铜绿微囊藻TY001有明显的抑制作用。5，4'-DHF胁迫可明显提高细胞内的活性氧水平，同时，prx基因和抗氧化酶(SOD、POD和CAT)的含量也明显上升。但是随着处理时间的增长，prx基因的表达量明显下降，抗氧化酶系统受到损伤，而活性氧水平持续增高，抗氧化酶不能清除过量的活性氧，导致细胞生理平衡受到破坏。从而，引起了脂质过氧化反应和MDA含量的增加，fabZ基因的表达量也明显下降，细胞膜也受到了极大的损伤。5，4'-DHF胁迫下，recA基因的表达量明显下降，可能铜绿微囊藻TY001的DNA受到了损伤。5，4'-DHF降低了sbA基因的表达量，光合作用中的电子传递和能量转移受到破坏，光合效率大大降低。5，4'-DHF没有提高微囊藻毒素合成基因mcyB基因的表达量，可能微囊藻毒素的合成量也会显著降低。以上结果表明，光合抑制、氧化损伤和DNA损伤是5，4'-DHF对铜绿微囊藻抑制的主要机理。5，4'-DHF是一种环境友好且抑藻效率高的化感物质，可应用于控制铜绿微囊藻水华。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 汾河太原河段水质现状及水华现象

1．2 水体富营养化及水华发生

1．2．1 中国湖泊富营养化程度及评价标准

1．2．2 水华暴发机制

1．3 水华的危害

1．3．1 影响自然景观

1．3．2 藻毒素的产生

1．3．3 异昧物质的产生

1．3．4 影响社会经济及人类生活

1．4 水华藻的分类

1．4．1 经典形态学分类方法

1．4．2 分子生物学分类方法

1．4．3 综合分类方法

1．5 水华的防治措施

1．5．1 物理法

1．5．2 化学法

1．5．3 生物法

1．6 化感物质及抑藻作用

1．6．1 化感作用的定义

1．6．2 水生和陆生植物对淡水藻类的化感作用

1．6．3 植物化感物质鉴定及对淡水藻类的化感作用

1．6．4 化感物质抑藻作用机理

1．7 本研究的目的及意义

第二章 汾河太原河段浮游植物多样性及水华藻的分离、鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 采样时间及位点

2．1．2 样品采集与处理

2．1．3 藻种的分离纯化

2．1．4 藻种的培养

2．1．6 分离纯化的微囊藻和裸藻的分子系统研究

2．2 实验结果

2．2．1 浮游植物区系组成及优势种

2．2．2 浮游植物细胞密度变化规律

2．2．3 形成水华的裸藻和微囊藻的形态特征及分布

2．2．4 形成水华的微囊藻的分子系统研究

2．2．5 形成水华的裸藻的分子系统研究

2．3 讨论

2．3．1 汾河太原河段浮游植物群落特征及优势种变化

2．3．2 微囊藻分子多样性讨论

2．3．3 汾河太原河段裸藻水华发生的探讨

2．3．4 汾河太原河段水质评价

2．4 小结

第三章 汾河太原河段微囊藻的产毒能力及产异味成因

3．1 材料与方法

3．1．1 微囊藻的采集、分离纯化及扩大培养

3．1．2 微囊藻基因组的提取和PCR扩增

3．1．3 总微囊藻毒素的提取及含量的测定

3．1．4 微囊藻产异味物质分析

3．2 实验结果

3．2．1 微囊藻产毒素基因的检测结果

3．2．2 产微囊藻毒素含量检测

3．2．3 产毒素基因的变化及多样性

3．2．4 微囊藻产异昧物质检测

3．3 讨论

3．3．1 汾河太原河段微囊藻产毒素基因及含量分析

3．3．2 汾河太原河段微囊藻产异味物质分析

3．4 小结

第四章 连苯三酚对铜绿微囊藻TY001的光合作用抑制机理

4．1 材料与方法

4．1．1 藻种培养及实验处理

4．1．2 铜绿微囊藻细胞完整性试验

4．1．3 连苯三酚对铜绿微囊藻TY001生长的影响

4．1．4 RNA的提取及检测

4．1．5 逆转录及qRT-PCR

4．1．6 连苯三酚对铜绿微囊藻叶绿素荧光的影响

4．1．7 统计分析

4．2 实验结果

4．2．1 连苯三酚对铜绿微囊藻细胞完整性的影响

4．2．2 连苯三酚对铜绿微囊藻生长的影响

4．2．3 RNA抽提结果

4．2．4 连苯三酚对铜绿微囊藻光合作用相关基因表达的影响

4．2．5 连苯三酚对铜绿微囊藻光系统Ⅱ的影响

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 连苯三酚对铜绿微囊藻TY001的氧化损伤、基因表达和微囊藻毒素合成的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 藻种培养及实验处理

5．1．2 铜绿微囊藻总蛋白含量、脂质过氧化物和抗氧化酶的测定

5．1．3 微囊藻毒素的提取及含量的测定

5．1．4 RNA的提取

5．1．5 逆转录及qRT-PCR

5．1．6 统计分析

5．2 实验结果

5．2．1 连苯三酚对铜绿微囊藻总蛋白含量的影响

5．2．2 连苯三酚对铜绿微囊藻丙二醛含量的影响

5．2．3 连苯三酚对铜绿微囊藻抗氧化酶的影响

5．2．4 基于SYBR Premix Ex Taq的quantitative real-time PCR

5．2．5 连苯三酚胁迫对铜绿微囊藻TY001目标基因表达量的影响

5．2．6 连苯三酚对铜绿微囊藻毒素含量的影响

5．3 讨论

5．4 小结

第六章 5，4'-二羟基黄酮(5，4'-DHF)对铜绿微囊藻TY001的抑制作用及机理

6．1 材料与方法

6．1．1 藻种培养及实验处理

6．1．2 5，4'-DHF对铜绿微囊藻TY001生长的影响

6．1．3 铜绿微囊藻脂质过氧化物和抗氧化酶的测定

6．1．4 细胞内活性氧(ROS)水平测定

6．1．5 RNA的提取

6．1．6 逆转录及qRT-PCR

6．2．1 5，4'-DHF对铜绿微囊藻TY001生长的影响

6．2．2 5，4'-DHF对铜绿微囊藻细胞内活性氧(ROS)水平的影响

6．2．3 5，4'-DHF对铜绿微囊藻丙二醛(MDA)含量的影响

6．2．4 5，4'-DHF对铜绿微囊藻3种抗氧化酶的影响

6．2．5 5，4'-DHF胁迫对铜绿微囊藻TY001目标基因表达量的影响

6．2．6 5，4'-DHF对铜绿微囊藻TY001光系统Ⅱ的影响

6．3 讨论

6．4 小结

第七章 结论与展望

7．1 研究结论

7．2 研究展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简况及联系方式

承诺书

声明