草履蚧肠道微生物群落多样性及其对宿主营养代谢的影响

摘要

草履蚧 Drosicha corpulenta(Kuwana)属于半翅目 Hemiptera，绵蚧科Margarodidae，是一种危害多种树木的植食性昆虫。草履蚧刺吸取食植物韧皮部的汁液，其成分单一难以满足草履蚧自身需求，而体内的共生菌能为其补充缺失的营养物质，从而影响草履蚧的生长发育。本文旨在探讨草履蚧肠道微生物种类多样性及肠道微生物对宿主营养代谢的作用，为以内共生菌为靶标的新型生物防治技术提供了理论基础。本研究的内容有：(1)选取杨树、柿树和核桃树3种寄主树木上二龄期和成虫期的草履蚧，使用高通量测序技术对其肠道内的细菌16S rDNA的可变区(V3+V4)进行测序，统计物种丰度，对内共生菌进行多样性及差异性分析。(2)测定3种寄主树木韧皮部的营养物质，分析寄主、草履蚧和肠道微生物的关系；经过复合抗生素处理，通过检测草履蚧血淋巴中营养物质的变化，分析肠道微生物的改变对草履蚧营养代谢的影响。研究结果如下：
　　1.不同寄主、不同龄期的草履蚧肠道细菌的多样性及差异性。
　　杨树、柿树、核桃树的二龄若虫期优势菌是拟杆菌门和变形菌门，其中拟杆菌门Bacteroides蟑螂杆状体科Blattabacteriaceae的Candidatus Uzinura比例分别为79%，81%和94%，变形菌门Proteobacteria肠杆菌科 Enterobacteriaceae的细菌分别占20%，6%和6%。
　　杨树、柿树、核桃树的成虫期优势菌门是拟杆菌门、变形菌门和放线菌门，其中拟杆菌门Bacteroides的Candidatus Uzinura比例分别为72%，59%和92%；变形菌门Proteobacteria的沃尔巴克氏体属Wolbachia分别占0.01%，12%和0.01%，变形菌门的另一种细菌Candidatus Lariskella分别占25%，0.001%和0.001%，肠杆菌科 Enterobacteriaceae的细菌分别占1.2%，0.2%和1.1%；放线菌门Actinobacteria微球菌科Micrococcales的节杆菌属Arthrobacter分别占0.7%，1%和2.4%，
　　α多样性分析显示成虫比二龄若虫的细菌种类多。获得属水平上已注释的细菌近70种。除了二龄若虫肠道中的优势菌Candidatus Uzinura和肠杆菌科的细菌外，成虫肠道中还增加了沃尔巴克氏体、Candidatus Lariskella、节杆菌属等27种细菌，其中杨树成虫独有的菌是Skermanella，柿树二龄虫独有的细菌是克吕沃尔菌属和副球菌属。在核桃树成虫中束村氏菌属、肠杆菌属、短波单胞菌属和链球菌属共占到0.15%。
　　2.三种寄主韧皮部的物质含量和肠道微生物的变化对宿主营养代谢的影响
　　实验测得杨树、柿树、核桃树韧皮部的总糖、还原糖、白白质、单宁含量，其中总糖和还原糖含量最高，说明草履蚧能从树皮中获得所需的糖类和能量。柿树和核桃树单宁含量高，单宁是植物防御昆虫的手段，通过肠道微生物的分析发现有降解单宁的细菌，从而破解植物的防御使草履蚧能够正常寄生生活。抗生素处理草履蚧取食的树枝，达到清除肠道细菌的目的。通过测定处理后的草履蚧血淋巴中葡萄糖、甘油三酯、白蛋白的含量，结果表明，肠道菌群的缺失，使草履蚧的蛋白质含量降低，葡萄糖和甘油三酯含量升高。
　　本实验对草履蚧不同寄主、不同龄期情况下的肠道微生物进行研究，得到了草履蚧肠道中优势菌群，种群结构，细菌功能预测等结果。验证了肠道微生物影响着草履蚧的营养代谢。为进一步确定优势菌和宿主蛋白质的利用提供理论依据，为开发生物防治技术提供新的思路。

目录

第一章 前言

1.1草履蚧

1.2昆虫肠道微生物的多样性

1.3 肠道微生物对宿主昆虫的作用

1.4 昆虫肠道微生物研究方法

1.5 本文研究内容、目的和意义

第二章 不同寄主、不同龄期草履蚧肠道微生物多样性分析

2.1材料和方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 解剖草履蚧的肠道

2.1.3 样品的总DNA提取

2.1.4 16S rDNA （V3+V4）可变区扩增

2.1.5 文库构建

2.2 结果和分析

2.2.1 测序数据质量评估

2.2.2 OUT分析

2.2.3 GC含量分析

2.2.4 物种分布柱状图和物种进化树

2.2.5 Alpha多样性分析

2.2.6 主成分分析和组间差异性分析

2.2.7 16S功能基因预测分析

2.3讨论

第三章 草履蚧肠道微生物的变化对其营养代谢的影响

3.1材料与方法

3.1.1 供试材料

3.1.2 仪器与试剂

3.1.3 寄主植物韧皮部有机物质的测定

3.1.4 草履蚧的抗生素处理

3.1.5 草履蚧血液中营养物质的检测

3.2 结果和分析

3.2.1 寄主植物韧皮部有机物质含量

3.2.2 抗生素对草履蚧体重的影响

3.2.3 抗生素对草履蚧血淋巴中葡萄糖的影响

3.2.4 抗生素对草履蚧血淋巴中甘油三酯的影响

3.2.5 抗生素对草履蚧血淋巴中蛋白质的影响

3.3 讨论

第四章 总结

参考文献

致谢

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