吡唑硫磷对映体对东亚飞蝗的选择毒性及其机制研究

摘要

东亚飞蝗是公认的农业害虫，每年均有蝗灾威胁。目前，国内外控制蝗灾的策略主要有可持续防治和应急防治两大方面。化学防治作为应急防治手段，优点众多，具有不可替代的作用。有机磷农药使用广泛，但超过30％的具有手性，不同的手性对映体对靶标生物大多具有毒性差异性。本文将探索有机磷农药吡唑硫磷各对映体对东亚飞蝗的选择毒性并进一步分析造成差异的原因，为开发高效低毒有机磷杀虫剂奠定理论基础。
　　本文利用高效液相色谱法(HPLC)对有机磷农药吡唑硫磷(pyraclofos)外旋体进行手性拆分。然后以东亚飞蝗三龄若虫为靶标生物进行毒力实验，LD50测定表明各手性对映体对蝗虫的毒性具有显著差异，表现为(+)-pyraclofos的毒性为(-)-pyraclofos毒性的70.16倍。通过检测相关解毒酶（羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和乙酰胆碱酯酶）的体内活性、体外抑制以及RT-PCR分析各相关酶基因表达，多角度多层次深入探讨造成pyraclofos手性对映体毒性差异的可能原因。CarEs相关实验结果为:1-萘基丁酸酯(α-NB)、乙酸-2-萘酯(β-NA)为底物时，(+)-pyraclofos处理组CarEs的活性高于(-)-pyraclofos处理组;以乙酸-1-萘酯(α-NA)为底物时，两者的CarEs活性差异不大。从体外CarEs抑制分析，各对映体对CarEs均有明显的抑制作用，表现为体外毒性不同:以α-NA和β-NA为底物时，(-)-pyraclofos的毒性分别是(+)-pyraclofos的6.86和10.27倍;以α-NB为底物时，(+)-pyraclofos的毒性是(-)-pyraclofos的3.49倍。LmCesA4的表达水平在低浓度下均有不同程度的上升;LmCesA5的表达均降低，但(-)-pyraclofos组的表达水平高于(+)-pyraclofos组。GSTs相关实验结果为:体内活性分析，经(-)-pyraclofos处理组的GSTs活性显著升高。体外抑制分析，(-)-pyraclofos的IC50远远大于(+)-pyraclofos。从10个GSTs的相关基因相对表达情况分析，LmGSTs2、LmGSTs5、LmGSTt1、LmGSTd1和LmGSTu1在(-)-pyraclofos处理组的表达水平高于(+)-pyraclofos处理组。AChE相关实验结果为:(-)-pyraclofos处理下AChE活性升高比例大于(+)-pyraclofos。体外抑制分析，(-)-pyraclofos对AChE的抑制为(+)-pyraclofos的4.14倍，但(-)-pyraclofos处理组在低浓度时Lm-ace1有较高的表达水平。
　　综上所述，对东亚飞蝗来说(+)-pyraclofos的毒性大于(-)-pyraclofos，造成这种毒性差异的原因可能是(-)-pyraclofos组LmCesA5、LmGSTs2、LmGSTs5、LmGSTt1、LmGSTd1、LmGSTu1及Lm-ace1的较高水平表达及相应CarEs、GSTs及AChE的较高活性使其水解(-)-pyraclofos的能力增高，表现为(+)-pyraclofos的毒性较大。至于更深的原因仍有待探究。

目录

摘要

第一章 综述

1．1 东亚飞蝗概述

1．1．1 东亚飞蝗的生物学特性

1．1．2 东亚飞蝗的危害

1．1．3 东亚飞蝗的防治

1．2 手性农药概述

1．2．1 手性农药及对映体选择毒性研究

1．2．2 手性农药的拆分

1．2．3 吡唑硫磷对映体的研究进展

1．3 昆虫有机磷农药的抗性研究

1．3．1 羧酸酯酶与昆虫抗性的关系

1．3．2 谷胱甘肽S-转移酶与昆虫抗性的关系

1．3．3 乙酰胆碱酯酶与昆虫抗性的关系

1．4．本课题研究的目的及意义

参考文献

第二章 吡唑硫磷的手性拆分及毒性研究

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 供试昆虫

2．2．2 实验试剂与设备

2．3 实验方法

2．3．1 吡唑硫磷的手性拆分

2．3．2 吡唑硫磷的急性毒性实验

2．3．3 实验数据处理

2．4 结果

2．4．1 吡唑硫磷外消旋体的分离

2．4．2 吡唑硫磷的急性毒性结果

2．4 结论

参考文献

第三章 CarEs与吡唑硫磷选择毒性的关系

3．1 前言

3．2 实验试剂与设备

3．3 实验方法

3．3．1 CarEs的体内活性测定和体外抑制测定

3．3．2 RT-PCR检测CarEs相关基因表达水平

3．3．3 实验数据处理

3．4 结果

3．4．1 CarEs体内活性测定和体外抑制结果

3．4．2 RT-PCR检测CarEs的表达水平

3．5 讨论

参考文献

第四章 GSTs与吡唑硫磷选择毒性的关系

4．1 前言

4．2 实验试剂与设备

4．3 实验方法

4．3．1 GSTs的体内活性测定和体外抑制测定

4．3．2 RT-PCR检测GSTs相关基因表达水平

4．3．3 实验数据处理

4．4 结果

4．4．1 GSTs活性的测定和体外抑制结果

4．4．2 RT-PCR检测GSTs的表达水平

4．5 讨论

参考文献

第五章 AChE与吡唑硫磷选择毒性的关系

5．3．1 AChE的体内活性测定和体外抑制测定

5．3．2 RT-PCR检测AChE相关基因的表达水平

5．3．3 实验数据处理

5．4 结果

5．4．1 AChE活性的测定和体外抑制结果

5．4．2 RT-PCR检测AChE的表达水平

5．5 讨论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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