多环芳烃降解菌的遗传改造及石油污染土壤的微生物部分修复

摘要

随着工业的发展，石油等化石燃料的消耗不断增加，以此同时给环境带来的污染越发严重，多环芳烃作为主要的污染物之一对生物的毒性最大。除去环境中的多环芳烃最好的方法就是微生物降解。本研究从实验室保存的一株能高效降解多环芳烃的多食鞘氨醇杆菌SWH-2中克隆出环羟基化双加氧酶大亚基的编码基因，并进行测序。将获得的基因通过基因工程技术转化到SWH-2的染色体DNA中，完成对SWH-2的遗传改造，得到一株新菌株SWH-21。降解实验表明SWH-21对多环芳烃的降解能力高于SWH-2。本实验还研究了SWH-21对石油污染土壤的修复情况。本课题主要研究成果如下:
　　 1.根据GeneBank上已有的环羟基化双加氧酶大亚基的编码基因序列，设计了一对简并引物。根据该引物的Tm值和GC含量，选择合适的PCR条件进行PCR，成功扩增出环羟基化双加氧酶大亚基的编码基因，并将该基因成功连接到pMD-18载体上，完成转化。
　　 2.将环羟基化双加氧酶大亚基的编码基因与自杀性质粒put-km1连接，成功构建出重组自杀性质粒，并成功转化入大肠杆菌DH5α—λpir。
　　 3.通过三亲杂交技术成功将环羟基化双加氧酶大亚基的编码基因整合到SWH-2菌的基因组中，完成了SWH-2菌的基因改造，得到了基因工程菌株SWH-21。分析对比了SWH-21菌与SWH-2菌对菲及石油的降解能力。其中SWH-21菌10天对菲的降解率高达64.32％，比SWH-2菌高出22.86％。
　　 4.将SWH-21菌与SWH-2菌应用到石油污染土壤的生物修复中，分析对比了这两种菌对石油污染土壤的修复情况，得出SWH-21与SWH-2对石油污染土壤的修复能力大致相同。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 环境中的PAHs

1．1．1 大气中的PAHs

1．1．2 土壤中的PAHs

1．1．3 水体中的PAHs

1．2 微生物降解PAHs的研究进展

1．2．1 真菌对PAHs的降解

1．2．2 细菌对PAHs的降解

1．2．3 其他微生物对PAHs的降解

1．2．4 PAHs的降解机制及影响因子

1．3 PAHs降解酶的研究现状

1．3．1 PAHs降解酶在PAHs降解中的作用

1．3．2 单加氧酶

1．3．3 双加氧酶

1．3．4 过氧化物酶及酪氨酸酶

1．4 PCR技术

1．4．1 PCR的基本原理

1．4．2 PCR反应体系及反应程序

1．4．3 引物的设计

1．5 石油污染土壤的生物修复

1．5．1 石油污染土壤的危害

1．5．1 生物修复

1．5 本论文的研究背景、内容及意义

第二章 实验方案设计与研究方法

2．1 材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 主要仪器与试剂

2．1．3 培养基

2．1．4 溶剂

2．2 研究方法

2．2．1 多食鞘氨醇杆菌SWH-2基因组的提取

2．2．2 环羟基化双加氧酶大亚基编码基因引物的设计

2．2．3 PCR扩增

2．2．4 PCR产物的回收及连接

2．2．5 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2．6 PCR产物的转化及蓝白斑筛选

2．2．7 质粒的提取——碱性SDS法

2．2．8 质粒的提取——试剂盒法

2．2．9 重组质粒的酶切鉴定

2．2．10 重组子的菌液PCR鉴定

2．2．11 三亲杂交及生长曲线的测定

2．2．12 气相色谱法测培养基中菲的含量

2．2．13 三角瓶中石油降解实验

2．2．14 菌剂的制作及生物修复石油污染土壤

2．2．15 索氏提取法测土壤中石油含量

第三章 结果与分析

3．1 SWH-2菌的遗传改造

3．1．1 细菌染色体DNA的提取

3．1．2 环羟基化双加氧酶大亚基的克隆

3．1．3 PCR产物与T载体的连接，转化和筛选

3．1．4 自杀性质粒的构建，转化及筛选

3．1．5 三亲杂交及生长曲线

3．2 菌SWH-21及菌SWH-2对菲及石油的降解

3．2．1 菲的降解实验

3．2．2 石油的降解实验

3．3 菌SWH-21对石油污染土壤的修复

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

附录