GRP78参与肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞之间正反馈调节的机制研究

摘要

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是肿瘤微环境中重要的间质细胞，主要表现M2型巨噬细胞的特征，能够通过分泌多种细胞因子和蛋白酶，为肿瘤细胞创造一个利于其发展的微环境。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是内质网中重要的应激蛋白，由于肿瘤细胞处于缺氧、缺糖以及酸性的微环境，所以常常导致GRP78在肿瘤细胞中的高表达，过量的GRP78能够突破内质网的限制，进入细胞核、线粒体、细胞质基质、细胞膜以及细胞的分泌物中，参与调控胞内信号并影响肿瘤微环境，促进肿瘤的发生发展。
　　TAM是肿瘤微环境中促进肿瘤发展的重要影响因素，高表达的GRP78也从多个方面发挥促肿瘤作用，两者在功能上具有相似之处;TAM受肿瘤微环境的招募和驯化常常聚集于肿瘤的缺氧部位，GRP78的高表达也常发现于肿瘤中心的缺氧区域，两者在定位上有相似之处;TAM出现于肿瘤发展的中后期，而GRP78的高表达也是由肿瘤中后期的恶劣环境所致，两者在出现的时间上具有相似之处;肿瘤相关巨噬细胞与GRP78在功能、空间和时间上的“巧合”，预示着GRP78可能参与了肿瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞之间的相互调控。探明GRP78在其中发挥的作用以及调控机制，对肿瘤靶向药物的开发具有重要的指导意义。本研究通过人巨噬细胞分化模型和GRP78分泌模型深入探究了TAM与GRP78的相互调控作用，并且针对GRP78在肿瘤细胞中的特性设计了靶向药物。具体研究内容如下:
　　第一部分:M2型巨噬细胞能够诱导肿瘤细胞中GRP78高表达，而高表达的GRP78在M2型巨噬细胞的促肿瘤迁移过程中发挥了重要作用。研究发现M2型巨噬细胞在促进肿瘤细胞迁移的同时能够诱导肿瘤细胞中GRP78高表达。进一步的机制研究发现，M2型巨噬细胞分泌的CCL17和CCL22能够与肿瘤细胞表面的CCR4受体结合，进而激活下游的PI3K/Akt信号。p-Akt能够抑制内质网Ca2+通道蛋白IP3R的活性，使Ca2+在内质网中发生聚集，进而促进ATF-6的剪切以及入核，最终导致GRP78表达的升高。如果利用shRNA干扰技术敲低GRP78的表达会明显减弱M2型巨噬细胞的促迁移效应。这部分研究结果，不仅表明高表达的GRP78在M2型巨噬细胞的促肿瘤迁移过程中发挥了重要作用，同时也突破了对“肿瘤的恶劣微环境是诱导GRP78高表达的主要原因”的一贯认知，揭示了GRP78在肿瘤细胞中高表达的新机制。
　　第二部分:肿瘤细胞中高表达的GRP78激活了自身的炎症反应，进而促进了肿瘤细胞的迁移。研究发现，肿瘤细胞中高表达的GRP78能够与STAT3和JAK2形成蛋白复合物，从而拉近STAT3与JAK2的距离，促进STAT3的磷酸化。p-STAT3能够进入细胞核并引起以IL-1β和TNF-α高表达为代表的肿瘤细胞自身炎症反应，而敲低IL-1β和TNF-α的表达也能够明显减弱M2型巨噬细胞的促迁移效应。这一发现不仅揭示了GRP78促进肿瘤细胞转移及恶化的新机制，还表明巨噬细胞可以通过诱发肿瘤细胞自身的炎症反应来维持肿瘤的炎症微环境，为“肿瘤相关巨噬细胞的免疫抑制特性”和“肿瘤的炎症微环境”之间的动态平衡提供了新的解释。
　　第三部分:肿瘤细胞中高表达的GRP78能够增强肿瘤细胞与基质之间的粘附，促进肿瘤细胞的上皮间质转化(EMT)。高表达的GRP78能够促进TGF-β1的表达和分泌，进而激活Smad2/3信号，p-Smad2/3又能够进一步促进Snail-2的表达，而Snail-2作为EMT过程的重要转录因子，调控了N-cadherin、Vimentin和E-cadherin等EMT关键标志物的表达，最终诱发肿瘤细胞EMT。另外，高表达的GRP78还激活了Fibronectin-integrin-β1-FAK信号，增强了肿瘤细胞与基质之间的粘附。这一发现阐明了GRP78通过改变细胞结构进而增强肿瘤细胞迁移能力的新机制。
　　第四部分:肿瘤分泌型GRP78能够诱导巨噬细胞向M2型极化。利用浓度梯度的DLD1细胞培养基或者纯化的GRP78蛋白处理RAW264.7细胞，能够使RAW264.7细胞呈现明显的分化形态。进一步的qRT-PCR、western blot和代谢组学检测发现，经GRP78处理后，RAW264.7细胞中M2型巨噬细胞标志物（CD206、Arg-1和IL-10）的表达明显升高，而M1型巨噬细胞标志物（CD80、iNOS和IL-12）的表达没有明显的变化，同时细胞中的糖酵解代谢减弱，脂肪酸代谢明显增强，表明经GRP78处理后，RAW264.7细胞呈现M2型巨噬细胞特征。这一研究结果首次证明肿瘤细胞分泌型GRP78能够诱导巨噬细胞向M2型极化，通过改造微环境发挥促肿瘤作用。
　　第五部分:针对GRP78构建的GBP-SubA融合蛋白能够靶向结合肿瘤细胞表面的GRP78，进而破坏细胞内的GRP78，最终导致肿瘤细胞凋亡。针对GRP78能够特异存在于肿瘤细胞表面并且能够促进肿瘤发展的双重特性，构建并表达纯化了GBP-SubA融合蛋白。GBP-SubA能够特异靶向肿瘤细胞表面GRP78，并破坏细胞内GRP78，最终导致细胞凋亡。GBP-SubA不但针对GRP78单一分子实现了靶向和杀伤肿瘤细胞的双重作用，而且还能通过影响肿瘤微环境发挥抗肿瘤效应，极具开发潜力。
　　本研究表明，TAM能够促进肿瘤细胞中GRP78的高表达，高表达的GRP78一方面能够通过刺激炎症、促进EMT、增强细胞与基质的粘附，提高肿瘤细胞的迁移能力;另一方面能够分泌到细胞外，促进微环境中巨噬细胞的M2型分化。在肿瘤细胞与TAM形成的正反馈调节中，GRP78发挥了重要作用。这一发现为以GRP78和肿瘤相关巨噬细胞为对象的研究提供新的思路。本研究中针对GRP78双重特性的重组靶向药物的构建和制备，也为后续抗肿瘤靶向药物的开发提供了可能。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 引言

2 肿瘤微环境与肿瘤相关巨噬细胞

2．1 肿瘤微环境的组成

2．2 肿瘤相关巨噬细胞的起源

2．3 肿瘤相关巨噬细胞的极化类型受肿瘤微环境调控

2．4 肿瘤相关巨噬细胞对微环境的改造

2．5 肿瘤相关巨噬细胞研究中存在的问题及展望

3 肿瘤细胞与GRP78

3．1 GRP78的基本结构和功能

3．2 GRP78对肿瘤细胞的影响

3．3 细胞分泌型GRP78对肿瘤微环境的影响

3．4 靶向GRP78的肿瘤干预策略

4 本课题的研究意义及研究内容

第二章 M2型巨噬细胞通过诱导肿瘤细胞GRP78高表达而促进其迁移

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料、仪器及试剂

2．2 细胞培养以及巨噬细胞的诱导极化

2．3 ELISA检测

2．4 GRP78 shRNA干扰质粒构建

2．5 细胞转染

2．6 Transwell细胞迁移和浸润实验

2．7 MTT细胞活性实验

2．8 Western blot实验

2．9 荧光定量PCR实验

2．10 流式细胞术检测巨噬细胞分型

2．11 免疫荧光检测细胞中钙离子变化情况

2．12 细胞内钙离子浓度和ATP浓度检测

2．13 数据统计与分析

3 实验结果

3．1 体外诱导人单核细胞分化为M1型和M2型巨噬细胞

3．2 20％的M2型巨噬细胞培养基能够诱导肿瘤细胞迁移

3．3 20％的M2型巨噬细胞培养基可以诱导肿瘤细胞中GRP78高表达

3．4 GRP78在M2型巨噬细胞诱导的肿瘤细胞迁移过程中发挥了重要作用

3．5 M2型巨噬细胞特异性分泌的CCL17和CCL22是肿瘤细胞中GRP78高表达的主要诱因

3．6 阻断CCL17／CCL22-CCR4信号可以抑制M2-MCM对肿瘤细胞GRP78的诱导

3．7 CCL17／CCL22-CCR4信号促进了肿瘤细胞内钙离子聚集以及ATF6的激活

3．8 CCL17／CCL22-CCR4信号能够通过PI3K／Akt信号抑制内质网钙离子通道蛋白IP3R的活性

3．9 抑制PI3K／Akt信号或激活IP3R可以缓解M2-MCM造成的钙离子聚集

3．10 激活IP3R可以抑制M2-MCM诱导的肿瘤细胞迁移

4 讨论

5 小结

第三章 高表达的GRP78通过激活肿瘤细胞自身炎症反应促进其迁移

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料、仪器及试剂

2．2 细胞培养

2．3 Western blot和荧光定量PCR

2．4 GRP78真核表达质粒及其截短和突变质粒的构建

2．5 GST和GST-GRP78蛋白的诱导表达和纯化

2．6 GST pulldown实验

2．7 免疫共沉淀实验

2．8 免疫荧光染色

2．9 稳定敲除GRP78的DLD1细胞株构建

2．10 小鼠肿瘤浸润实验

2．11 HE染色和免疫组化实验

2．12 数据统计与分析

3 实验结果

3．1 M2型巨噬细胞的条件培养基能够激活肿瘤细胞的炎症反应

3．2 IL-1β和TNF-α在M2-MCM诱导的肿瘤细胞迁移过程中发挥了关键作用

3．3 GRP78介导了M2-MCM对肿瘤细胞的炎症诱导

3．4 GRP78促进了STAT3的磷酸化以及入核

3．5 GRP78与STAT3存在相互作用

3．6 GRP78的底物结合结构域介导了GRP78与STAT3的相互作用

3．7 GRP78的底物结合活性促进了STAT3的磷酸化

3．8 JAK2介导了GRP78对STAT3的磷酸化作用

3．9 GRP78在M2型巨噬细胞诱导的小鼠肿瘤浸润过程中发挥了关键作用

3．10 临床样本中GRP78的表达与M2型巨噬细胞的浸润及STAT3的磷酸化呈正相关

4 讨论

5 小结

第四章 高表达的GRP78能够通过调节粘附以及上皮间质转化促进肿瘤细胞迁移

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料、仪器及试剂

2．2 细胞培养

2．3 稳定过表达GRP78的DLD1细胞株构建

2．4 细胞粘附实验

2．5 细胞划痕实验

2．6 免疫荧光染色

2．7 Western blot和qRT-PCR实验

2．8 数据统计与分析

3 实验结果

3．1 高表达的GRP78能够促进肿瘤细胞迁移

3．2 高表达的GRP78能够促进肿瘤细胞与基质的粘附

3．3 Fibronectin-integrin-β1-FAK信号介导了GRP78的促粘附作用

3．4 高表达的GRP78激活了肿瘤细胞的上皮间质转化

3．5 Snail-2参与了GRP78对肿瘤细胞上皮间质转化的调控

3．6 TGF-β信号参与了GRP78对粘附以及上皮间质转化的调控

3．7 高表达的GRP78通过激活TGF-β／Smad2／3信号促进肿瘤细胞迁移

4 讨论

5 小结

第五章 肿瘤细胞分泌的GRP78促进了巨噬细胞的M2型极化

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料、仪器及试剂

2．2 细胞培养

2．3 细胞培养基中GRP78的去除

2．4 His-GRP78的表达纯化以及内毒素的去除

2．5 氢核磁共振(1H NMR)代谢组学备样

2．6 1H NMR测试条件及数据处理

2．7 Western blot和荧光定量PCR

2．8 数据统计与分析

3 实验结果

3．1 肿瘤细胞分泌的GRP78参与了巨噬细胞的极化过程

3．2 纯化的GRP78能够诱导巨噬细胞极化

3．3 纯化的GRP78能够诱导RAW264．7细胞中M2型巨噬细胞标志物的表达

3．4 纯化的GRP78影响巨噬细胞代谢产物的核磁图谱指认

3．5 GRP78处理前后巨噬细胞中代谢产物的多元统计分析

3．6 GRP78诱导RAW264．7细胞向M2型巨噬细胞极化

4 讨论

5 小结

第六章 靶向肿瘤细胞GRP78的重组亚麻酶胞毒素的表达、纯化以及肿瘤靶向效应评估

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料、仪器及试剂

2．2 细胞培养

2．3 质粒构建

2．4 GBP-SubA蛋白诱导表达

2．5 GBP-SubA蛋白纯化

2．6 流式细胞术检测细胞表面GRP78

2．7 细胞增殖实验

2．8 流式检测细胞凋亡

2．9 TUNEL检测细胞凋亡

2．10 免疫荧光染色

2．11 Western blot实验

2．12 数据统计与分析

3 实验结果

3．1 重组质粒的构建

3．2 GBP-SubA蛋白表达条件的优化

3．3 GBP-SubA蛋白的纯化

3．4 用于检测GBP-SubA活性的细胞模型筛选

3．5 重组蛋白GBP-SubA的活性检测

3．6 重组的GBP-SubA蛋白能够抑制肿瘤细胞的生长

3．7 封堵细胞表面的GRP78能够阻断GBP-SubA的凋亡诱导作用

4 讨论

5 小结

总结与展望

参考文献

缩略词表

研究成果

致谢

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