白细胞介素1β诱导衰老成纤维细胞促进角膜新生血管形成的实验研究

摘要

目的：
　　 本试验拟研究IL-1β对正常和衰老角膜成纤维细胞状态和基因表达的影响，以及IL-1β处理后正常和衰老成纤维细胞对血管内皮细胞增殖、迁移、成管能力上的差别，同时体内观察正常和衰老的成纤维细胞，以及经IL-1β处理后的正常和衰老成纤维细胞影响角膜新生血管生长方面的区别。
　　 方法：
　　 1.人角膜基质成纤维细胞（human comeal fibroblasts，HCF）原代及传代培养:供体人角膜取自于眼球捐献者，无菌条件下，采用消化法原代培养人角膜成纤维细胞，4～5代内进行试验。
　　 2.实验分组:应用300μMH2O2诱导人角膜成纤维细胞衰老，10ng/mlIL-1β处理正常和衰老的成纤维细胞。衰老成纤维细胞采用衰老相关的β-半乳糖苷酶染色检测。
　　 细胞分为以下四组。正常对照组（A组）:正常人角膜成纤维细胞常规培养;衰老角膜成纤维细胞组（B组）:H2O2诱导人角膜成纤维细胞衰老;IL-1β组（C组）:IL-1β处理正常角膜成纤维细胞;IL-1β处理的衰老角膜成纤维细胞组（D组）:IL-1β处理衰老角膜成纤维细胞。
　　 3.Real-time PCR检测各组细胞新生血管相关因子MMPs、VEGF、PEDF、tPA、uPA等的表达。收集四组细胞条件培养液，对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical VeinEndothelial Cells，HUVECs)进行诱导处理，采用MTT比色法测定不同成纤维细胞对血管内皮细胞的增殖能力的影响，Transwell法测定其对血管内皮细胞迁移能力的影响，Matrigel成管实验评估其对血管内皮细胞成管能力的影响。
　　 4.体内试验应用C57/BL6小鼠，分为A、B、C、D四组，左眼为手术眼，行角膜基质内细胞注射，右眼为对照眼，A组注射正常角膜成纤维细胞，B组注射衰老角膜成纤维细胞，C组注射IL-1β诱导的正常角膜成纤维细胞，D组注射IL-1β诱导的衰老角膜成纤维细胞，并于术后3天、5天、7天、10、14天裂隙灯观察眼前节情况并照相，观察记录角膜新生血管形成情况。
　　 结果：
　　 1.人角膜基质细胞原代和传代培养
　　 光镜下观察发现角膜缘组织消化接种2～3天后可见少许细胞爬出，呈梭形排列整齐，4～5天后，相邻细胞连接向周围生长，1周后融合，传代培养2周后，细胞呈现典型的成纤维细胞形态。
　　 2.处理后四组角膜成纤维细胞光镜下观察:B组衰老角膜成纤维细胞形态较A组正常成纤维细胞体积变大，胞浆内颗粒增多增粗，SA-β-gal染色阳性;C组和D组由IL-1β处理正常和衰老的角膜成纤维细胞，前者细胞较正常略有增大，细胞连接紧密;后者细胞增大增宽，排列疏松，胞浆颗粒增多，有双核现象。
　　 3.Real-time PCR检测各组细胞新生血管相关因子MMPs、VEGF、tPA、uPA、uPAR等的表达，B、C、D组均明显高于A组(P＜0.05)，PEDF、TSP1、TSP2、COL1A1、COL4A1，B、C、D组明显低于A组（P＜0.05）;D组与B组比较，MMP1、MMP2、MMP3、MMP13、tPA、uPA显著升高（P＜0.05），PEDF、TSP1、TSP2、COL1A1明显下降（P＜0.05）;D组与C组比较，MMP1、MMP2、MMP3显著升高(P＜0.05），PEDF、TSP1、TSP2、COL1A1明显下降(P＜0.05)。B、C、D组HUVECs的增殖、迁移、成管数量明显高于A组(P＜0.05);D组迁移、成管数量明显高于B、C组(P＜0.05)，但增殖活性的提高不具有统计学意义(P＞0.05)。
　　 4.裂隙灯观察小鼠术后角膜新生血管情况，A组术后3天角膜缘血管扩张充血，7天时无新生血管长入角膜;B、C组术后3天角膜缘血管扩张充血，7天时新生血管开始向注射区域生长，10天时长入注射区域;D组术后3天注射区域角膜缘有新生血管长入，7天时有大量新生血管向注射区域生长，10天时大量新生血管长入注射区域。
　　 结论：
　　 1.衰老的角膜成纤维细胞能够显著上调新生血管促进因子VEGF和MMP的表达，并能显著下调新生血管抑制因子PEDF、TSP1和TSP2的表达水平。
　　 2.IL-1β诱导的衰老成纤维细胞比正常细胞和衰老细胞更能够显著上调新生血管促进因子VEGF和MMP的表达，并能显著下调新生血管抑制因子PEDF、TSP1和TSP2的表达水平。
　　 3.IL-1β诱导的衰老成纤维细胞比正常细胞和衰老细胞在体外更能促进血管内皮细胞增殖、迁移、成管能力，体内更易诱导角膜新生血管的生长。

目录

声明

摘要

主要符号表

引言

第一章 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 人角膜成纤维细胞

1．1．2 人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)

1．1．3 实验动物

1．2 实验仪器与耗材

1．2．1 实验仪器

1．2．2 实验耗材

1．2．3 实验试剂

1．2．4 主要溶液配制

1．3 实验方法

1．3．1 细胞培养

1．3．2 衰老相关β-半乳糖苷酶染色

1．3．3 免疫荧光检测细胞衰老标记物

1．3．4 Real-time PCR检测四组细胞新生血管相关因子的表达

1．3．5 细胞增殖能力检测

1．3．6 细胞迁移能力检测

1．3．7 血管内皮细胞成管能力检测

1．3．8 角膜新生血管体内实验

第二章 结果

2．1 细胞培养

2．1．1 角膜基质细胞原代和传代培养

2．1．2 H2O2诱导人角膜成纤维细胞衰老

2．1．3 IL-1β处理角膜成纤维细胞

2．2 衰老相关β-半乳糖苷酶染色

2．3 衰老细胞免疫荧光染色

2．4 正常和衰老成纤维细胞新生血管相关因子mRNA水平的表达变化

2．5 正常和衰老成纤维细胞对血管内皮细胞增殖能力的影响

2．6 正常和衰老成纤维细胞对血管内皮细胞迁移能力的影响

2．7 正常和衰老成纤维细胞对血管内皮细胞成管能力的影响

2．8 正常和衰老成纤维细胞对角膜新生血管生长的影响

讨论

结论

参考文献

综述 衰老的成纤维细胞在角膜新生血管形成中的作用

攻读学位期间取得的研究成果

致谢