基于核酸适配体构象变化的抗生素电化学传感器研究

摘要

抗生素作为一种微生物的代谢产物，具有杀死或抑制微生物生长的作用。近年来作为抗菌药物被广泛应用于治疗各种非病毒感染疾病，尤其是在畜牧业和农业中的应用越来越广泛。抗生素的过量和不正当使用导致了它在食物中的残留量逐年增加。人们长期食用含有抗生素残留的食物会导致体内抗生素的富集，使人体对抗生素产生抗药性，同时也诱导产生了超级细菌。近年来食物中抗生素残留问题受到世界各国的极大关注，很多国家也制定了一系列有关食物中抗生素的最大残留量指标。但是现存检测抗生素的传统方法均受到各种内在外在条件的限制。因此，迫切需要研究一种高灵敏性、高选择性的检测食物中抗生素残留量的方法。本文利用电化学传感手段结合核酸适配体的构象变化构建了检测食品中抗生素残留量的生物传感器。构建的传感器对待测目标物均表现出较低的检测限和较宽的线性范围，并有良好的选择性和稳定性，在实际样品的检测中也得到了较好的回收率。
　　本论文主要进行了以下几方面研究：
　　1.通过在修饰了纳米金/石墨烯-壳聚糖复合物的玻碳电极上自组装巯基化的孔雀石绿适配体来构建一个基于电化学传感体系的RNA适体传感器来灵敏、特异得检测孔雀石绿的电化学传感器。电极构建完成后，先将烷硫醇固定在纳米金表面来形成统一的修饰，并减少非特异性吸附。然后将修饰好的电极在含有孔雀石绿的体系中孵育，目标物孔雀石绿可以诱导其适配体发生构象变化，并特异性的结合孔雀石绿，从而将目标分子固定在电极表面。然后再将标记有辣根过氧化物酶的孔雀石绿抗体修饰到电极上，由于抗原抗体之间的特异性识别作用，将辣根过氧化物酶固定在电极表面。最后通过读取辣根过氧化物酶催化的过氧化氢的电还原信号来实现孔雀石绿的定量检测。结果显示，构建的传感器对孔雀石绿具有较低的检测限：16.3 pg mL-1和宽的线性范围：1×10-4-10μg mL-1。因此，基于RNA适配体构建的电化学检测策略能够简单、快速、便宜、高灵敏和高特异性的定量检测孔雀石绿。
　　2.在这项工作中，基于目标物与适配体杂交诱导的二次循环放大技术，构建了一种用于超灵敏和高选择性的检测抗生素的简单、快速、低成本的电化学生物传感器。巧妙设计的发夹探针由目标抗生素的适配体、内切酶识别序列和互补杂交序列组成。有检测目标物存在时，目标物会与发夹探针上的适配体杂交，诱导发夹构象发生变化，暴露出来的单链末端会捕获均相中游离的信标探针，以固定的信标探针为引物，发生链延伸反应，生成完全互补的双链结构并把目标物游离出来，循环利用。生成的双链中含有内切酶的识别序列，在内切酶与聚合酶的共同作用下，会产生成百上千的单链。产生的单链可以消耗溶液中的信标探针导致电化学信号降低，从而实现目标物的定量检测。据我们所知，这项工作是第一次将基于目标物与适配体杂交诱导的二次循环放大技术用于电化学分析检测抗生素。在最佳条件下，所构建的生物传感器具有超宽的检测范围5 pM-10 nM和极低的检测限1.09 pM。此外，本研究的生物传感器也显示对目标物氨苄青霉素具有高选择性，并具有检测速度快、成本低，操作简单等优点。因此，基于目标物与适配体杂交诱导的二次循环放大技术用于检测氨苄青霉素的电化学方法具有用于实际中相关食品安全分析和临床诊断的潜力。
　　3.基于多重循环放大技术构建了一种超灵敏检测抗生素的电化学DNA传感器。该多重循环放大包括聚合酶辅助的目标物循环放大和核酸外切酶辅助的二级目标物循环放大。在实验过程中，巧妙设计的发夹探针会被目标物与适配体之间的特异性杂交打开，并引发聚合酶诱导的目标物循环放大反应，产生成千上万的二级目标物。值得注意的是，产生的二级目标物不仅能够与剩下的发夹探针发生反应，也能置换下电极上的辅助探针。使亚甲基蓝标记的发夹探针自身折叠形成稳定的发夹构象，并获得较高的电化学还原峰。经过多重的信号放大技术构建的传感器可以超灵敏的检测目标抗生素，其最低检测限可达1.3 fM。据我们所知，这项工作首次将多重循环放大与正信号的传感策略结合用来定量检测抗生素。该策略也可进一步结合更多的分析手段来检测更多的目标物，所以该传感手段具有构建超灵敏的生物传感平台进行生物分析，疾病诊断和临床药物的潜力。