酶响应性短肽自组装水凝胶及其在细胞培养中的应用

摘要

水凝胶是以水作为分散介质的凝胶型材料。由于其微观结构为空间网状结构，这类材料具备良好的支撑性能；同时，与空间网状结构互补的孔道结构使其具备良好的渗透性，因而这类材料在组织工程、再生医学及药物控释方面具有良好的应用前景。目前，小分子组装是制备水凝胶的常用方法之一，而肽分子因具备合成容易、功能多样、组装体形貌可控等优点，成为小分子组装法制备水凝胶的原材料。在疏水作用、静电作用、氢键等非共价力的作用下，肽分子可形成功能多样的纳米带、纳米纤维等结构，进而形成水凝胶。通过将酶特异性识别的短肽片段合理的嵌入至肽分子中，可得到组装良好的、对酶响应的短肽自组装体系，这类体系能够在生物内源性酶的作用下实现凝胶的形成、降解、功能化等多种功能；同时，由于具有酶响应性，这类分子可作为底物参与体内的酶促反应，为这类材料的应用提供了新的思路。 在本论文中，我们设计并合成了一系列基于短肽 Ac-I3K-NH2自组装模型的酶响应性短肽并对其组装行为进行了初步研究，在此基础上考察了所设计短肽在细胞培养方面的应用。具体研究内容如下： （1）设计并合成了对谷氨酰胺转氨酶（TGase）响应的系列短肽分子，并对其在HEPES缓冲溶液中的纳米带自组装形貌及β-sheet二级结构进行了表征，明确了加酶后体系中单体的二聚化过程，由此说明凝胶形成的机制是酶促反应产物的进一步组装；评价了短肽及其水凝胶的细胞毒性和免疫源性，将其用于大鼠的肝脏止血过程中，并指出其止血机制分为物理性包敷止血和激活血小板、参与凝血的生理反应这两个部分。 （2）设计并合成了基质金属蛋白酶-2（MMP-2）响应性短肽 Ac-I3SLKG-NH2，表征了其纳米纤维自组装体即β-sheet的二级结构，以及对基质金属蛋白酶的响应机理（如形貌的五规划、二级结构的解体、储能模量的降低）、酶促降解过程，并研究了凝胶的细胞毒性以及在细胞在凝胶表面的迁移特征；进一步构建了能够对癌细胞进行选择性杀伤的亲水性药物载体并成功进行了其选择性和杀伤效果的验证。 （3）设计并合成了两类双酶响应性的短肽分子，即对血浆氨氧化酶-基质金属蛋白酶双响应性分子Ac-I3SLKGK-NH2和谷氨酰胺转氨酶-基质金属蛋白酶双响应性分子Ac-I3SLKGQ-NH2，并分别先后加入血浆氨氧化酶（PAO）、MMP-2和TGase、MMP-2至两组装体系中，考察了在交联酶（PAO，TGase）作用下凝胶的形成及在MMP-2作用下凝胶的降解过程，以及在这两个过程中两组装体系在形貌、二级结构、流变学特征方面的变化。借助这种双酶响应性，这两类组装体系能够在酶的作用下形成水凝胶，并利用其降解性能引导细胞向凝胶内部的自发迁移。 综上所述，在本论文中，我们按照外基质形成至降解的过程分别设计了两种单一酶响应性短肽自组装体系及两种双酶响应性短肽自组装体系，并对其细胞毒性及初步应用进行了探索，实现了在短肽组装模型下水凝胶的酶促降解及双酶响应性，拓展了酶响应性水凝胶的研究范围，为组织工程材料提供了新的选择。

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