有益菌A18菌株铁载体的研究和铁吸收调节蛋白（Fur）基因的克隆和表达

摘要

利用甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸钠、溴化乙啶(EB)和紫外线(UV)对海洋有益细菌A18(Alteromonasaurantia)进行复合诱变，得到一株铁载体高产菌株J61321。对J61321抑菌活性[以鳗弧菌W-1(Vibrioanguillarum)作为指示菌]、所产铁载体的种类以及其性质进行了研究，结果显示出发菌株A18及突变株J61321所产铁载体均属于异羟肟酸类，而指示菌W-1所产铁载体为儿茶酚类；突变株J61321在铁载体产量、抑菌活性、对沸水浴的耐受性以及抗铁螯合剂方面都优于出发菌株A18。对铁载体高产菌株J61321的生长和产铁载体的液体培养条件进行了优化。采用单次单因子(one-variable-at-a-time)方法对培养基组分(碳源、氮源)和培养条件(起始pH、培养温度)进行了优化研究，最终得到突变株J61321的最佳培养基和培养条件为：酵母粉0.1％(W/V)，蛋白胨0.2％(W/V)，FePO40.001％(W/V)，培养温度28℃，摇床转速180rpm，pH7.5，在生长20小时后铁载体达到最大产量。研究了A18和J61321菌株的生长量(OD600nm)、铁载体产量和抑菌活性随培养时间的变化，结果显示二者的生长量差距不大(p＞0.05)，铁载体产量和抑菌活性之间存在显著性差异(p＜0.05)。 利用有机溶剂萃取法和大孔径树脂吸附法两种方法分别提取铁载体粗品，经HPLC初步分离，收集抑菌活性和CAS检测结果均为阳性的组分。利用高效液相色谱/二极管阵列检测/质谱法对活性组分进行再次分离，采用ESI-MS，采集正离子质谱数据，根据分离组分的分子离子峰推测组分Ⅰ为铁色素，组分Ⅱ为铁草铵(ferrioxamine)。 以橙色交替单胞菌A18中提取的染色体DNA为模板，根据革兰氏阴性菌fur同源性设计的上下游引物，通过PCR技术扩增到A18的fur基因。将PCR产物克隆到T载体上，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆进行DNA序列分析，结果表明PCR扩增的DNA片段编码148个氨基酸，与GenBank报道的革兰氏阴性菌的相应序列同源性很高(与大肠杆菌的Fur蛋白的相似性为70％，与Alteromonassp0-7的相似性为97％)，通过在线结构模拟，发现其结构与已经报道的Fur蛋白的结构相同。将橙色交替单胞菌fur基因克隆到非融合表达载体pQE上，构建表达质粒pQE-fur，转化大肠杆菌QCl732，筛选表达菌株QC1732(pQE-fur)。实验结果发现，在富铁条件下，通过IPTG诱导表达的Fur蛋白可以抑制铁载体的合成和分泌。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写表

第一章微生物的铁载体

1.0前言

1.1铁载体的概念

1.2铁载体的检测

1.2.1化学方法

1.2.2生物方法

1.3铁载体介导的铁吸收

1.3.1微生物中的铁吸收

1.3.2微生物从铁载体获取铁的机制

1.3.3微生物铁载体-铁的跨膜运输可能有三种机制

1.4微生物中的其它铁运输系统

1.4.1 Feo系统

1.4.2 ABC(ATP-binding cassette)系统

1.5产铁载体的海洋微生物

1.6铁载体的结构

1.7铁吸收调节蛋白-Fur

1.7.1 Fur蛋白—整体铁依赖性的调节器

1.7.2 E.coli中fur基因的调节

1.7.3 Fur元件

1.7.4 Fur的正调节

1.7.5大肠杆菌中Fur控制铁的消耗

1.7.6其它细菌中的Fur

1.8.铁载体的潜在用途

1.8.1类酚氧化酶活性（纸浆的漂白）

1.8.2石油烃的生物降解

1.8.3海洋中铁、碳、氮循环中的作用

1.8.4鱼病的控制

1.8.5医疗上的应用

1.8.6环境修复

1.8.7核燃料的再生或回收

1.8.8铁载体的其它用途

1.9结束语

第二章铁载体高产菌株的选育

2.0前言

2.1材料与方法

2.1.1菌种

2.1.2培养基

2.1.3培养条件

2.1.4诱变处理

2.1.5胞外产物的制备

2.1.6抑菌活性的测定——杯碟法

2.1.7铁载体的检测

2.1.8外膜蛋白的提取

2.1.9 SDS-PAGE检测

2.2结果与讨论

2.2.1菌种的选育

2.2.2突变株J61321胞外产物特性的研究

2.2.3铁载体的检测

2.2.4铁离子浓度对菌株A18和J61321生长和产铁载体的影响

2.2.5铁螯合剂的影响

本章小结

第三章铁载体高产菌株培养条件的优化

3.0前言

3.1材料与方法

3.1.1菌种

3.1.2培养基

3.1.3培养条件

3.1.4三角瓶装液量的研究

3.1.5培养基初始pH值、培养时间、温度、摇床转速的研究

3.1.6生物量的测定

3.1.7胞外产物的制备参照

3.1.8抑菌活性的测定——杯碟法参照

3.1.9铁载体的检测参照

3.1.10测定摇瓶培养的A18与突变株J61321不同时间的生长量、铁载体量和抑菌活性

3.2结果与讨论

3.2.1碳源和氮源对J61321的生长、铁载体产量及其抑菌活性的影响

3.2.2培养温度对J61321产铁载体量及其抑菌活性的影响

3.2.3通气量对J61321铁载体量及其抑菌活性的影响

3.2.4起始pH对J61321铁载体量及其抑菌活性的影响

3.2.5 A18与突变株J61321摇瓶培养的生长曲线、铁载体量和抑菌活性的比较

本章小结

第四章J61321所产铁载体的分离提纯与结构分析

4.0前言

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与讨论

4.2.1铁载体的分离纯化

4.2.2电喷雾—液/质联用(ESI-LC/MS)质谱

本章小结

第五章橙色交替单胞菌(A.aurantia)铁吸收调节蛋白(Fur)基因的克隆、测序、结构模拟和表达

5.0前言

5.1材料与方法

5.1.1实验材料

5.1.2实验方法

5.2结果与讨论

5.2.1橙色交替单胞菌的fur基因的克隆

5.2.2橙色交替单胞菌的fur基因的核苷酸序列

5.2.3橙色交替单胞菌的fur基因编码的FUR蛋白序列分析

5.2.4fur基因编码的氨基酸序列的同源性比较

5.2.5 Fur蛋白的结构模拟结果

5.2.6橙色交替单胞菌的fur基因在大肠杆菌QC1732中表达

5.2.7讨论

本章小结

论文的创新点和展望

参考文献

致谢

附博士期间文章发表情况