赤潮藻亚历山大藻LC3培养及谷氨酸铜对其灭除机制研究

摘要

近年来，赤潮在世界各地海域频繁爆发，且规模不断扩大，造成了巨大的经济损失，并危害了人类的生存环境。亚历山大藻(Alexandrium)是一种全球分布的常见赤潮藻种，其属下的30余种甲藻约一半为有毒种类，进行亚历山大藻发生及防治的研究对于由其引发的赤潮的防治具有重要意义。 人们己对诱发亚历山大藻赤潮发生的环境因子做了一些研究，这些研究多集中在营养盐(氮、磷等)对亚历山大藻增殖的影响上，随着研究的深入，人们开始重视微量重金属元素(铁、锰等)对藻增殖的影响。杀灭赤潮生物的主要方法有粘土法、化学药剂法等。利用硫酸铜治理赤潮曾是国内外长期采用的方法，但直接利用硫酸铜易造成局部浓度过高，进而对非赤潮生物及海洋生态环境产生不利影响。目前国际上公认的一种治理赤潮方法是撒播粘土法，在过去25年中，许多国家对其进行了研究。尽管粘土被人们视为是一种有效且有发展潜力的控制赤潮方法，但粘土的局部不适用、高昂的运输费用以及短效性，使得这种方法的应用受到了限制。因此，寻找新型杀藻剂并研究其杀藻效果及杀藻机制意义重大。 本研究以亚历山大藻LC3为研究材料，对其发生赤潮条件进行初步研究，并利用电镜技术、双向电泳技术及质谱技术对新型杀藻剂的杀藻机制进行研究。 (1)利用正交试验研究氮、磷、铁、锰四种物质对亚历山大藻LC3生长的影响，比较无机营养盐及微量金属元素对亚历山大藻LC3增殖影响的大小顺序。结果显示，无机氮对藻的生长有促进作用，882～2646μmol/L浓度时亚历山大藻LC3生长较好，2646μmol/L下生长速率略快。无机磷对亚历山大藻LC3生长的影响差异显著，一定浓度的磷对LC3的生长有促进作用。铁及锰对藻生长均有促进作用，分别在3.5μg/L的铁浓度下及18～36μg/L的锰浓度下藻可获得较快的生长速率。四种元素对亚历山大藻LC3生长均有促进作用，各元素对生长影响的大小顺序依次为：磷＞锰＞氮＞铁。 (2)为寻找新型有效的杀藻剂，对辣椒素、过碳酸钠、硫酸铜、谷氨酸铜对亚历山大藻LC3的杀灭效果以及表面活性剂(HDTMAB)对谷氨酸铜杀藻的促进作用进行研究。结果表明，辣椒素在较低浓度下(0.1，1.0，10.0mg/ml)对亚历山大藻LC3无明显杀灭作用，达到杀藻的目的所需辣椒素量较大；过碳酸钠对亚历山大藻LC3的杀灭率偏低，为此认为这两种物质均不适宜用于赤潮防治。谷氨酸铜可有效杀灭亚历山大藻LC3，其对亚历山大藻LC3的灭杀效率优于硫酸铜，优势随时间延长而明显，但其对藻的抑制作用并不随谷氨酸铜的浓度加大而增强。HDTMAB可有效促进谷氨酸铜杀灭亚历山大藻LC3，促进作用基本随着HDTMAB浓度的提高而逐步增强。谷氨酸铜和HDTMAB复合剂可有效去除亚历山大藻LC3，在赤潮治理中将具有较好的应用前景。 (3)借助扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)，对谷氨酸铜、HDTMAB、硫酸铜以及谷氨酸铜-HDTMAB协同作用下亚历山大藻LC3细胞形态及超微结构的变化进行研究。结果表明，谷氨酸铜、HDTMAB、硫酸铜或协同胁迫下，藻的质膜(细胞膜、叶绿体膜、线粒体膜等)完整性遭到了破坏，这表明质膜是这些胁迫物质攻击的目标。谷氨酸铜、HDTMAB等胁迫物严重破坏了叶绿体、线粒体等的结构，这些变化直接影响了亚历山大藻LC3的呼吸及光合作用，抑制了该藻的生长，甚至导致细胞死亡。铜离子胁迫下，亚历山大藻LC3细胞内淀粉颗粒、脂质体等数量增加，在液泡、细胞核以及细胞膜等部位观察到了不透明黑色沉淀，这些物质可能与藻细胞解除金属毒性有关。 (4)对谷氨酸铜对亚历山大藻LC3细胞膜透性、丙二醛(MDA)及巯基含量的影响进行研究，并比较谷氨酸铜和HDTMAB复合作用时，不同浓度表面活性剂作用下藻细胞膜脂过氧化水平、细胞膜功能状态及巯基含量的变化，以对谷氨酸铜和HDTMAB杀灭赤潮藻的机制进行初步探讨。结果表明，谷氨酸铜对亚历山大藻LC3的杀灭主要靠铜离子的毒性作用，且谷氨酸可以增加铜离子穿透细胞膜的能力，0.5×10-3mol/L谷氨酸铜可促使藻细胞MDA含量与细胞质膜透性明显升高，使巯基含量下降，这表明谷氨酸铜杀灭赤潮藻的机制是使藻细胞膜受到损伤，膜的透性增大，细胞内物质大量外渗，进而抑制藻细胞生长。HDTMAB可有效促进谷氨酸铜杀灭有害赤潮藻，其作用机理是由于与细胞膜结合，增加膜透性，使细胞膜功能受到破坏。谷氨酸铜、HDTMAB胁迫下，这些生理指标的变化验证了透射电镜观察的结果，即谷氨酸铜、HDTMAB作用于亚历山大藻LC3时攻击质膜，使质膜遭到破坏的结论。 (5)用HDTMAB和Ca2+复合作用杀灭亚历山大藻LC3，对Ca2+在HDTMAB杀灭亚历山大藻LC3过程中的作用进行初步研究。比较不同浓度Ca2+对HDTMAB杀灭亚历山大藻LC3的影响，结果表明，Ca2+可明显抑制HDTMAB对亚历山大藻LC3的杀灭，浓度为4mmol/L时Ca2+对HDTMAB杀灭亚历山大藻LC3的抑制效应最显著。通过对Ca2+抑制HDTMAB杀灭亚历山大藻LC3机制的初步探讨发现，Ca2+及HDTMAB复合处理组与单纯HDTMAB处理组相比，MDA含量降低，巯基含量升高，细胞质膜透性减小。这表明，Ca2+对亚历山大藻LC3细胞抗HDTMAB胁迫的促进作用主要是通过稳定细胞膜、降低细胞膜透性实现的。 (6)对亚历山大藻LC3细胞蛋白质提取纯化及其双向电泳技术进行研究。通过SDS-PAGE分析，发现其蛋白质分子量主要集中于14～31kDa以及43～66kDa这两个区域，其中尤以较低分子量的14～31kDa这一区间中的蛋白条带最多。对双向电泳蛋白样品制备方法进行优化，藻蛋白质双向电泳图谱结果显示，蛋白质相对分子量约在14～100kDa范围内，主要分布在14～31kDa之间，这与SDS-PAGE结果一致；蛋白质的等电点分布在pH3.0～8.0的范围内，主要分布在酸性端的3.0～6.0范围内，采用pH3.0～5.6范围的IPG预制胶条获得了理想的分离效果，可分离出320个左右蛋白质斑点，结合pH3.0～10.0以及pH3.0～5.6的IPG预制胶条，可较好的分离亚历山大藻LC3蛋白质。 (7)利用SDS-PAGE对HDTMAB促进谷氨酸铜杀灭亚历山大藻LC3的机制进行进一步的研究。结果发现，HDTMAB可造成藻蛋白表达量大幅降低，与对照组及单纯谷氨酸铜处理组相比，蛋白条带较少。利用SDS-PAGE及2-DE对谷氨酸铜杀灭亚历山大藻LC3的机制进行进一步的研究，结果显示，谷氨酸铜作用造成分子量大于31kDa的蛋白表达量大幅降低，但谷氨酸铜处理也诱导了一些低分子量蛋白质的合成，这些低分子量蛋白可能是藻细胞在逆境胁迫下的一种自我保护。本节实验结果显示，谷氨酸铜杀灭亚历山大藻LC3及HDTMAB促进杀灭的另一机制为：造成藻细胞内的部分蛋白质变性和解体，进而抑制藻细胞生长。 (8)对3个谷氨酸铜胁迫下亚历山大藻LC3双向电泳图谱上的差异蛋白点，用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行肽质量指纹图谱分析，并通过数据库检索进行蛋白质的鉴定。分析比较数据库的检索结果，筛选最合适匹配的记录，发现1号蛋白与一种共生甲藻(Symbiodiniumsp.)的Ⅱ型1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)的前体(大亚基)匹配最好；2号蛋白与单细胞绿色鞭毛植物(Mesostigmaviride)的RNA聚合酶β亚基匹配最好；3号蛋白则与一种红藻(Guillardiatheta)的一种未知功能的蛋白最相似。1、2号蛋白均为在对照处理组中表达而在谷氨酸铜胁迫下受抑制的蛋白。造成谷氨酸铜胁迫下Rubisco(1号蛋白)表达缺失的原因主要有三方面：(1)谷氨酸铜胁迫造成的Rubisco的氧化修饰使Rubisco降解成无活性的小片段；(2)叶绿体结构遭破坏，促进了谷氨酸铜对Rubisco合成的抑制；(3)Rubisco作为胞内重要储藏蛋白发生降解，这可能是细胞对胁迫的一种自主反应。氧化修饰及叶绿体结构遭破坏也是RNA聚合酶(2号蛋白)受抑制的原因。3号蛋白是亚历山大藻LC3在谷氨酸铜胁迫下生成的新蛋白，这可能是藻细胞在逆境胁迫下的一种自我保护。 综上所述，谷氨酸铜对亚历山大藻LC3具有较强的灭除作用，其杀灭赤潮藻效率优于硫酸铜。HDTMAB可有效促进谷氨酸铜杀灭有害赤潮藻，且促进作用基本随着HDTMAB浓度的提高而同步增强。对谷氨酸铜及HDTMAB等胁迫下，亚历山大藻LC3在细胞生理活性(膜透性、MDA及巯基含量)、形态及超微结构等方面均发生了显著变化，这些变化说明，谷氨酸铜和HDTMAB通过破坏细胞膜来抑制藻的生长。利用2-DE及质谱技术对胁迫条件下的蛋白变化进行的研究表明，谷氨酸铜可造成藻细胞内的部分蛋白质变性和解体，进而抑制藻细胞生长。谷氨酸铜杀藻的机制可以归结为两点：(1)使藻质膜受到损伤；(2)造成藻细胞内的部分蛋白质变性和解体。谷氨酸铜和HDTMAB复合剂可有效去除亚历山大藻LC3，在赤潮治理中将具有较好的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1赤潮及其危害性

1.2赤潮发生原因及研究进展

1.2.1生物因素

1.2.2化学因素

1.2.3物理因素

1.3赤潮防治技术及研究进展

1.3.1物理方法

1.3.2化学方法

1.3.3生物方法

1.3.4赤潮防治技术的研究进展

1.4亚历山大藻赤潮的危害性

1.4.1产毒亚历山大藻的毒害机理

1.4.2亚历山大藻的防治

1.5差异蛋白质组学研究及其在海洋生物中的应用

1.5.1蛋白质组学研究的背景及意义

1.5.2差异蛋白质组学研究

1.5.3常用的差异蛋白质组学研究方法

1.5.4差异蛋白质组学在海洋生物中的应用

2氮、磷、铁、锰对亚历山大藻LC3生长的影响

2.1材料和方法

2.1.1实验材料

2.1.2培养基

2.1.3培养条件

2.1.4正交表设计

2.1.5生长测定

2.2结果与讨论

2.2.1氮、磷、铁、锰对亚历山大藻LC3生长速率的影响

2.2.2讨论

2.3结语

3不同杀灭剂对亚历山大藻LC3灭除的初步研究

3.1材料和方法

3.1.1实验材料

3.1.2藻细胞计数方法

3.1.3不同浓度辣椒素灭杀亚历山大藻LC3的测定

3.1.4不同浓度过碳酸钠灭杀亚历山大藻LC3的测定

3.1.5硫酸铜、谷氨酸铜对亚历山大藻LC3灭杀对比

3.1.6谷氨酸铜浓度对亚历山大藻LC3存活率的影响

3.1.7复合作用下HDTMAB浓度对亚历山大藻LC3存活率的影响

3.2结果

3.2.1不同浓度辣椒素对亚历山大藻LC3的杀灭结果

3.2.2不同浓度过碳酸钠对亚历山大藻LC3的杀灭结果

3.2.3硫酸铜、谷氨酸铜杀灭亚历山大藻LC3对比试验结果

3.2.4不同浓度谷氨酸铜对亚历山大藻LC3的杀灭结果

3.2.5复合作用下HDTMAB浓度对谷氨酸铜杀灭亚历山大藻LC3的影响

3.3讨论

3.3.1辣椒素及过碳酸钠对亚历山大藻LC3的灭除

3.3.2谷氨酸铜对亚历山大藻LC3的灭除

3.3.3 HDTMAB对谷氨酸铜杀灭亚历山大藻LC3的促进

3.4结语

4硫酸铜、谷氨酸铜以及表面活性剂对亚历山大藻LC3形态和超微结构的影响

4.1材料和方法

4.1.1实验材料

4.1.2不同处理下亚历山大藻LC3的培养

4.1.3亚历山大藻LC3细胞形态的扫描电镜观察

4.1.4亚历山大藻LC3细胞超微结构的透射电镜观察

4.2结果

4.2.1无胁迫时亚历山大藻LC3的细胞形态及超微结构

4.2.2谷氨酸铜胁迫对亚历山大藻LC3细胞形态及超微结构的影响

4.2.3谷氨酸铜和HDTMAB协同胁迫对亚历山大藻LC3细胞形态及超微结构的影响

4.2.4 HDTMAB胁迫对藻细胞形态及超微结构的影响

4.2.5硫酸铜胁迫对藻细胞形态及超微结构的影响

4.3讨论

4.3.1胁迫对亚历山大藻LC3质膜的损伤

4.3.2胁迫对亚历山大藻LC3叶绿体及线粒体的损伤

4.3.3亚历山大藻LC3对胁迫毒性的响应

4.4结语

5谷氨酸铜和表面活性剂协同灭除亚历山大藻LC3机制的初步研究

5.1材料和方法

5.1.1实验材料

5.1.2谷氨酸铜对亚历山大藻LC3细胞丙二醛、巯基含量及质膜透性影响的测定

5.1.3复合作用下HDTMAB浓度对亚历山大藻LC3细胞丙二醛、巯基含量及质膜透性影响的测定

5.1.4 TBA法测定丙二醛(MDA)含量

5.1.5 DTNB显色法测定巯基含量

5.1.6电导法测定细胞质膜透性

5.2结果

5.2.1谷氨酸铜胁迫对亚历山大藻LC3细胞中丙二醛、巯基含量及细胞膜透性的影响

5.2.2复合作用下不同浓度HDTMAB对丙二醛、巯基含量及细胞膜透性的影响

5.3讨论

5.3.1谷氨酸铜对亚历山大藻LC3细胞生理活性的影响

5.3.2复合作用下HDTMAB浓度对亚历山大藻LC3细胞生理活性的影响

5.4结语

6外源Ca2+对HDTMAB杀灭亚历山大藻LC3效果的影响及其机制初步研究

6.1材料和方法

6.1.1实验材料

6.1.2复合作用下Ca2+浓度对亚历山大藻LC3存活率影响的测定

6.1.3复合作用下Ca2+浓度对亚历山大藻LC3细胞丙二醛、巯基含量及质膜透性影响的测定

6.2结果

6.2.1不同浓度Ca2+对HDTMAB杀灭亚历山大藻LC3的影响

6.2.2复合作用下浓度Ca2+对亚历山大藻LC3细胞丙二醛含量的影响

6.2.3复合作用下浓度Ca2+对亚历山大藻LC3细胞巯基含量的影响

6.2.4复合作用下浓度Ca2+对亚历山大藻LC3细胞质膜透性的影响

6.3讨论

6.4结语

7亚历山大藻LC3蛋白质组双向电泳图谱的构建

7.1材料和方法

7.1.1实验材料

7.1.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白样品制备

7.1.3双向凝胶电泳蛋白样品的提取和定量

7.1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离

7.1.5双向凝胶电泳分离

7.1.6染色

7.1.7图像分析及数据处理

7.2结果

7.2.1亚历山大藻LC3细胞可溶性蛋白质SDS-PAGE结果

7.2.2亚历山大藻LC3细胞可溶性蛋白质双向电泳结果

7.3讨论

7.3.1亚历山大藻LC3细胞破碎

7.3.2亚历山大藻LC3双向电泳样品溶解缓冲液

7.3.3亚历山大藻LC3双向电泳样品浓缩及脱盐

7.4结语

8利用SDS-PAGE和双向电泳技术进行谷氨酸铜灭除亚历山大藻LC3的机制研究

8.1材料和方法

8.1.1实验材料

8.1.2藻种处理及蛋白提取、电泳分离

8.2结果

8.2.1复合作用下HDTMAB浓度对亚历山大藻LC3蛋白表达影响的SDS-PAGE结果

8.2.2谷氨酸铜对亚历山大藻LC3细胞蛋白表达影响的双向电泳结果

8.3讨论

8.3.1复合作用下HDTMAB对亚历山大藻LC3蛋白表达的影响

8.3.2谷氨酸铜对亚历山大藻LC3蛋白表达的影响

8.4结语

9亚历山大藻LC3蛋白质双向电泳差异蛋白肽质量指纹图谱分析与鉴定

9.1材料和方法

9.1.1实验材料

9.1.2质谱样品的制备

9.1.3质谱样品分析

9.1.4数据库查询

9.2结果

9.3讨论

9.3.1谷氨酸铜胁迫下1，5-二磷酸核酮糖羧化酶表达的抑制

9.3.2谷氨酸铜胁迫下RNA聚合酶表达的抑制

9.3.3谷氨酸铜胁迫下新蛋白的表达

9.4结语

10结论

10.1氮、磷、铁、锰对亚历山大藻LC3生长均有促进作用

10.2谷氨酸铜和HDTMAB可有效杀灭亚历山大藻LC3

10.3亚历山大藻LC3形态和超微结构在硫酸铜、谷氨酸铜以及表面活性剂等胁迫下发生变化

10.4谷氨酸铜和表面活性剂作用下亚历山大藻LC3膜透性、丙二醛及巯基含量发生变化

10.5外源Ca2+对HDTMAB杀灭亚历山大藻LC3的抑制及其机制

10.6通过利用pH 3.0～10.0及pH 3.0～5.6的IPG预制胶条构建亚历山大藻LC3蛋白质组双向电泳图谱

10.7利用SDS-PAGE和双向电泳技术研究谷氨酸铜灭除亚历山大藻LC3的机制

10.8谷氨酸铜胁迫下亚历山大藻LC3蛋白质双向电泳差异蛋白肽质量指纹图谱分析与鉴定

参考文献

致谢

附录 在读研究生期间所投稿和发表的论文