大菱鲆红体病虹彩病毒的核酸探针检测及病毒感染牙鲆鳃细胞系的研究

摘要

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是优质的海水鱼类养殖品种，近年来大菱鲆的工厂化养殖在我国北方沿海地区迅猛发展，成为我国北方重要的海水鱼类养 殖产业。然而，目前我国养殖大菱鲆的病害问题却越来越严重，已经威胁其健康发展。2001年，在我国多个大菱鲆养殖场开始流行一种可导致大菱鲆鱼苗和养成鱼大量死亡的疾病，患病和垂死的大菱鲆最主要的外观特征是体表无明显损伤，鱼体无眼侧(腹面)沿脊椎骨附近皮下淤血、发红；患病严重时病鱼鳍和鳍基部也有弥散性出血，整个鱼体腹面呈粉红色。经电镜观察，在病鱼的鳃、肠、脾、肾等多个组织内发现了一种似虹彩病毒(Iridovims-1ike)的严重感染。进一步的研究表明，该病毒是一种新的鱼类虹彩病毒，暂命名为大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus，TRBIV)。 本研究针对该病病原大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)建立了核酸探针检测技术。应用PCR技术制备了非放射性标记物地高辛(DIG)标记的TRBIV DNA探针，通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证，结果表明其对TRBIV重组质粒pGAPZaA-MCP的检出灵敏度为2.095 pg，相当于4.561×10<'5>个TRBIV重组质粒pGAPZaA-MCP拷贝。可检出48 ng患红体病大菱鲆肾组织匀浆液、23 ng感染红体病病毒的大菱鲆脾组织匀浆液，而与健康大菱鲆组织匀浆液和组织DNA，LCDV DNA均不发生交叉反应。 大菱鲆虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus，TRBIV)是虹彩病毒科，肿大细胞病毒(Megalocytivirus)，这个属的病毒具有的特点是，不容易感染培养细胞，至今为止只有真鲷虹彩病毒感染培养细胞成功的报道(Oshima et al,1998)。而TRBIV作为一种新的鱼类虹彩病毒分离株，国内外尚未有其敏感细胞系的研究报道。本论文开展了大菱鲆红体病病毒(TRBlV)感染牙鲆鳃细胞系(Flounder gill cell line，FG)的研究。FG细胞在接种TRBIV后出现了典型的细胞病变(Cytopathic effect，CPE)，通过电子显微镜对感染细胞进行观察，发现感染细胞中有病毒粒子，衣壳呈典型的六角形，核心大小为60～80 nm，在细胞内空泡中发现大量的未完全装配的空的病毒衣壳，这是在病毒复制过程中生成的。同时观察到病毒通过裂解细胞而大量释放。表明病毒在FG细胞中进行了复制并完成了复制循环。在20℃和24℃培养条件下，对病毒的形态和增殖情况进行了观察，确定20℃是病毒较适的培养温度。实验结果表明FG细胞是TRBIV敏感细胞系，可以用于病毒的大量繁殖，为该病毒今后的研究工作的开展奠定了一定的基础。

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1综述 鱼类虹彩病毒研究进展

2.利用PCR法制备地高辛标记的探针检测大菱鲆红体病虹彩病毒

3.TRBIV感染牙鲆鳃细胞系

参考文献

致谢