大菱鲆红体病虹彩病毒核酸疫苗及两种海水名贵鱼类疾病的研究

摘要

随着人们对水产品需求量的增加,水产养殖业得到了快速发展。但大规模高密度养殖造成的水环境污染,致使水产病害日趋严重,特别是病毒性疾病造成的损失更加惊人。当前,我国海水鱼养殖者大多使用化学合成或抗生素类药物治疗疾病,但是由于药物残留、诱导抗药性菌株以及水体污染等副作用,成为制约我国水产事业发展的瓶颈。与传统疫苗相比,基因疫苗具有独特的优势,比如生产成本低、可与其他免疫原组成多价疫苗、可诱导机体产生强烈而持久的免疫应答等。目前,水产养殖界基因疫苗的研究尚处于起步阶段,国外主要集中在鲑鱼、鳟鱼类的IHNV、VHSV、SVCV、SHRV等传染性病毒病的防治上。迄今未见有大菱鲆红体病虹彩病毒基因疫苗的研究报道。本论文应用生物信息学,筛选出TRBIV25R(核糖核酸还原酶R2p小亚基)和TRBIV47R(血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子家族区域)两个候选的抗原基因;应用分子克隆技术构建了两种大菱鲆红体病虹彩病毒基因疫苗:pVAX147R和pVAX125R并在草鱼肾细胞CKI以及模式动物剑尾鱼(Xiphophorushelleri)中进行表达的研究,结果表明pVAX147R在细胞及剑尾鱼体内均能有效的表达,在剑尾鱼体内能有效表达约40天,且在第20天左右表达量最高。而pVAX125R在细胞及剑尾鱼体内均无表达;对注射pVAX147R的剑尾鱼进行了免疫效果评价,结果表明注射该疫苗后剑尾鱼的重要免疫相关基因IgM表达量显著增高,说明pVAX147R能有效刺激鱼体产生免疫应答;对基因疫苗PVAX1-47在剑尾鱼体内的表达时间及安全性进行研究,并初步探讨了其免疫机制。本文对大菱鲆红体病虹彩病毒基因疫苗的生产应用和产业化提供了重要的理论依据。
　　 除此之外,作者还对七带石斑鱼(EpinephelusseptemfasciatusThunberg)、沙虎鲨(Carchariastaurus)两种海水名贵鱼类的疾病进行研究。
　　 七带石斑鱼隶属于鲈形目(Perciformes)、(魚旨)科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus),是该属中大型的石斑鱼类。其肉质细嫩、味道鲜美,深受消费者的喜爱。日本和韩国消费需求旺盛,是一种极具市场潜力的高档名贵海水鱼类品种。2009年6月初,某养殖场培育的一批七带石斑鱼,部分稚鱼开始出现眼球内部充气,眼球突出,游动缓慢等症状,随着病症的加重,稚鱼开始出现眼角膜白浊、失明、眼球脱落、体表泛红、不进食等症状,最终导致死亡。我们从患病的七带石斑鱼体内分离出一株致病菌BY0081,研究了该菌株的致病性,分析了其生理生化指标和16SrDNA序列,将该菌株鉴定为假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.),并进一步研究了其药敏特性。该结果对防治由假交替单胞菌引起的鱼类疾病有积极意义。
　　 沙虎鲨,又名锥齿鲨、戟齿砂鲛或戟齿锥齿鲨,是一种生活在海岸海域的鲨鱼。2009年10月,山东某海底世界一条沙虎鲨因病意外死亡,我们对其致病因素从细菌、寄生虫、病毒多方面考察,最终确定其为弧菌(Vibrio)和淋巴囊肿病毒(LvmphocvstisdiseasevirusLCDV)混合感染死亡。该结果有助于水族馆内鲨鱼的疾病控制。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.1 鱼用基因疫苗

1.2 鱼用基因疫苗的构建

1.2.1 抗原基因的选择

1.2.2 载体的选择

1.3 佐剂的选择

1.3.1 油佐剂

1.3.2 细胞因子

1.3.3 CpG-ODNs的免疫刺激作用

1.4 DNA疫苗作用机理及免疫评估

1.4.1 DNA疫苗作用机理

1.4.2 DNA疫苗免疫效果评估

1.5 鱼类DNA疫苗的接种方式

1.5.1 注射法

1.5.2 基因枪法

1.5.3 浸泡法

1.6 DNA疫苗的优缺点

1.7 生物安全

1.8 展望

第二章 pVAX1-25和pVAX1-47基因疫苗重组质粒的构建

2.1 材料和方法

2.1.1 病毒模板来源

2.1.2 抗原基因的筛选

2.1.3 pMD18-T-TRBIV质粒的提取

2.1.4 TRBIV-25RR和TBIV-47R的PCR扩增

2.1.5 pVAX1-25和pVAX1-47重组质粒的构建与扩增

2.2 结果

2.2.1 抗原基因筛选

2.2.2 引物设计

2.2.3 TRBIV 25R和47R的扩增结果

2.2.4 pVAX1质粒载体的提取

2.2.5 TRBIV 25R和47R以及pVAX1质粒的酶切、纯化及定量

2.2.6 pVAX1-25R和pVAX1-47R重组质粒的提取及酶切鉴定

2.2.7 pVAX1-25R和pVAX1-47R的测序结果

2.3 讨论

第三章 pVAX1-25和pVAX1-47在细胞和鱼体内的表达研究

3.1 材料和方法

3.1.1 材料

3.1.2 试剂

3.1.3 pVAX1-25R和pVAX1-47R在细胞水平的表达研究

3.1.4 pVAX1-25R和pVAX1-47R在鱼体内的表达研究

3.2 结果

3.2.1 细胞水平上的RT-PCR和PCR检测结果

3.2.2 荧光定量PCR检测pVAX1-25R和pVAX1-47R在鱼体内的表达

3.3 讨论

第四章 核酸疫苗pVAX1-47免疫效果评价

4.1 材料和方法

4.1.1 材料

4.1.2 引物设计

4.1.3 cDNA的制备

4.1.4 荧光定量检测IgM基因的变化

4.2 结果

4.3 讨论

第五章 基因疫苗安全性评价

5.1 材料和方法

5.1.1 材料

5.1.2 试剂

5.1.3 引物设计

5.1.4 各组实验鱼的生理观察

5.2 结果

5.2.1 pVAX1-47R和口pVAX1的检测

5.2.2 生理观察

5.3 讨论

第六章 石斑鱼源致病性假交替单胞菌的分离鉴定及药敏特性

6.1 材料和方法

6.1.1 试验鱼

6.1.2 细菌的分离与纯化

6.1.3 人工感染试验

6.1.4 病原菌毒力的测定

6.1.5 纯化菌株的生理生化鉴定

6.1.6 16S rDNA序列测定及分析

6.1.7 药物敏感试验

6.2 结果与分析

6.2.1 致病菌的分离及毒力的测定

6.2.2 病原菌的鉴定

6.2.3 药敏试验结果

6.3 讨论

第七章 沙虎鲨致死病因的分析及鉴定

7.1 材料和方法

7.1.1 材料

7.1.2 试剂

7.1.3 组织观察

7.1.4 细菌的分离与纯化

7.1.5 人工感染实验

7.1.6 16S rDNA序列测定及分析

7.1.7 药物敏感试验

7.1.8 组织DNA和RNA的提取

7.1.9 病毒检测

7.2 结果

7.2.1 致病菌的分离及毒力的测定

7.2.2 病原菌的鉴定

7.2.3 药敏试验结果

7.2.4 病毒检测结果

7.2.5 组织观察

7.3 讨论

参考文献

致谢