扣囊复膜酵母海藻糖合成代谢的初步研究

摘要

海藻糖在生物圈内无处不在，其独特的物理化学特性使其成为细胞应激代谢物，在不同的逆境胁迫中保护生物大分子。海藻糖在工业中有极好的应用前景，如在干燥和冷冻期间维持细胞膜的完整性；增加多种不稳定物质的稳定性；提高冷冻细胞的生存能力；提高生物物质如酶、疫苗等的稳定性；在食品和制药工业中作为冷冻保护剂和高效保存剂等。 在本实验室前期工作中，从土壤中分离到一株能利用淀粉合成海藻糖的野生型扣囊复膜酵母菌株，该菌株在含淀粉的培养基中经48h发酵可积累占细胞干重18％的海藻糖，但细胞内海藻糖酶活力较高，分解合成的海藻糖，对海藻糖积累不利。本研究以该野生型酵母为出发菌株，经过EMS诱变，得到一株中性和酸性海藻糖酶活力均显著降低的突变株A11，突变株A11在含淀粉培养基中的生长能力并未下降，但经48h发酵，细胞内海藻糖的积累量却比野生型细胞提高了50％。 为了解扣囊复膜酵母A11海藻糖的合成代谢，通过实验确定了该菌株海藻糖的生物合成途径，结果表明其海藻糖合成途径与啤酒酵母和大肠杆菌的一样，即由UDP-葡萄糖与6-磷酸葡萄糖在6-磷酸海藻糖合成酶催化下合成6-磷酸海藻糖，然后由6-磷酸海藻糖磷酸酯酶催化下合成海藻糖。该合成途径的关键酶6-磷酸海藻糖合成酶经过超滤浓缩、Sepharose CL,-4B和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析等系列纯化过程，经SDS-PAGE和Native-PAGE电泳检测，都呈现一条66kDa的条带，证实6-磷酸海藻糖合成酶被纯化，纯化倍数33倍，收率61％。SDS-PAGE和Native-PAGE电泳上显示的结果，说明扣囊复膜酵母6-磷酸海藻糖合成酶与啤酒酵母和其他真核生物的不同。 对纯化的6-磷酸海藻糖合成酶的生化特性进行研究表明，该酶反应的最适温度是37℃，最适pH6.6，酶的温度和pH稳定性均很差；Ca<'+2>、k<'+>和Mg<'2+>对酶活性有激活作用，最适激活浓度分别是10 mmol/L、35 mmol/L和35 mmol/L，说明该酶是金属酶；而Cu<'2+>，Fe<'3+>，Hg<'2+>，CO<'2+>对酶活性有抑制作用，Hg<'2+>对酶的抑制作用说明,酶活性中心存在含吲哚基团的氨基酸残基;EDTA、PMSF。和碘乙酸对酶活力均有很大的抑制作用,而二硫苏糖醇(DTT)对酶活性有保护作用。EDTA对酶的抑制作用证实该酶是金属酶,PMSF和碘乙酸对酶的抑制作用表明,该酶的活性中心存在半胱氨酸(Cys)和丝氨酸(Ser)残基;纯化酶对UDPG的Km和Vmax分别为9.9 mmol/L,和11.83 nmol/min;对6-P-G的Km和Vmax分别为40.2 mmol/L和8.38 nmol/min。海藻糖是酒精酵母的应激代谢物,在正常生理条件下,细胞内海藻糖含量、6.磷酸海藻糖合成酶活力以及6-磷酸海藻糖合成酶基因表达量均很低,当细胞处于逆境胁迫时,它们都会显著增加。为研究不同逆境胁迫对扣囊复膜酵母A11海藻糖积累的影响,对处于对数生长初期的细胞施加各种逆境胁迫,发现所有施加的逆境胁迫均不能提高细胞内海藻糖的含量和6-磷酸海藻糖合成酶的活力。为从转录水平上研究不同逆境胁迫对该菌株海藻糖积累的影响,采用CoDeHOP引物设计策略,设计简并引物,对扣囊复膜酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因进行简并PCR扩增,得到基因的部分序列,根据该序列设计特异引物,进行RT-PCR,检测细胞内6-磷酸海藻糖合成酶基因的mRNA水平,发现在不同逆境胁迫中该菌株的6-磷酸海藻糖合成酶基因的表达量稳定不变。因此,扣囊复膜酵母海藻糖的积累模式、6-磷酸海藻糖合成酶的激活作用以及6-磷酸海藻糖合成酶基因的表达模式,与酒精酵母和其他真菌的明显不同,扣囊复膜酵母海藻糖的合成对逆境胁迫不应答。 本研究结果表明扣囊复膜酵母A11的6-磷酸海藻糖合成酶以及海藻糖的积累机制明显不同于已研究的酒精酵母和其他多数真核生物。

目录

文摘

英文文摘

第一章绪论

第二章扣囊复膜酵母海藻糖酶基因缺陷突变株的筛选

第三章扣囊复膜酵母海藻糖合成途径的确定

第四章扣囊覆膜酵母A11细胞内6-磷酸海藻糖合成酶的分离纯化及特性研究

第五章6-磷酸海藻糖合成酶部分基因的克隆

第六章不同逆境条件下海藻糖的积累和tps1基因的表达

结论、创新点与展望

参考文献

攻读博士学位期间发表和接收的论文

致谢