节旋藻/螺旋藻基因组特性初探及硝酸盐转运蛋白基因克隆与序列分析

摘要

节旋藻／螺旋藻(Arthrospria/SPirulina)因其重要的经济价值和特殊的生物学性质而受到广泛关注。虽然其分子遗传学研究开展较早，但与其它已测序模式蓝藻集胞藻(Synechocystis)PCC 6803、聚球藻(Synechococcus sp．)WH 8120、鱼腥藻(Anabaena)PCC 7120和念珠藻(Nostoc punctiforme)等相比，其研究进展十分缓慢。目前已克隆并发表的节旋藻基因仅30多个，有关节旋藻基因组学研究尚属空白，对节旋藻基因组特性更加缺乏了解。本研究针对节旋藻自身结构和成分上的特点，通过优化实验方法构建了极大节旋藻(Arthrospria maxima．)FACHB438高分子量、高覆盖率的基因组fosmid文 库。该文库含有4300个克隆，重组频率是97.1[％]，插入片段平均大小为36.1kb，覆盖了节旋藻基因组的27.9倍。高分子量、高覆盖率节旋藻基因组文库的构建为物理图谱的绘制及最终全基因组测序奠定基础，同时也为开展比较基因组学、基因定位克隆等研究奠定基础。 以序列标签位点(STS)为路标构建重叠群图谱是目前最普遍、最经典、分辨率最高的物理作图方法。本研究随机挑选了100个克隆进行双末端测序，并挑选了14对特异性的STS序列设计引物，以1536个克隆为模板，根据STS-PCR反 应池方案筛选了127个种子克隆，根据这些克隆之间的重叠位置关系拼接了4 个连续的重叠克隆群，为最终节旋藻物理图谱的绘制奠定了基础。 同时，又随机挑选了一些克隆进行末端测序，共得到602个高质量的序列。这些序列总长为307，547bp，覆盖节旋藻基因组5.70[％]。序列相似性分析筛查到287条序列与已知功能的基因高度匹配，63条为假说蛋白(hypothetical protein)基因，另外发现了252条新基因，比例高达41.8[％]。密码子和GC含量分析表明：极大节旋藻密码子使用没有明显的偏倚性，密码子第一、二、三位GC含量分别为46.9[％]，39.8[％]和45.5[％]，基因组GC含量为43.6[％]；节旋藻基因组和编码区的GC含量与丝状蓝藻鱼腥藻PCC 7120和念珠藻(Nostoc punctiforme)相近，与单细胞的蓝藻相差较大。对已知功能的基因进行KEGG分类,共参与17种不同的代谢途径,其中参与复制、修复,信号转导,碳代谢等途径的基因较多。同时,发现有25个序列编码来自于同一物种的反转录酶,进一步分析表明它们属于一个同源簇基因,推测该基因在节旋藻细胞中可能以高拷贝的形式存在,在节旋藻进化及代谢调控方面可能发挥重要作用。同时发现编码二元信号转导系统(two-component singal transdution,TCST)和ABC(ATP-binding cassette)转运系统基因家族元件的序列也相对较多。本研究又对节旋藻硝酸盐/亚硝酸盐转运系统中的转运蛋白基因进行了克隆和序列分析,该基因长1515 bp,编码504个氨基酸,其中疏水性氨基酸含量较高,达47.6[％],推测该序列含有12个跨膜α螺旋区,同时也发现了保守的蛋白激酶C识别基序。该基因的密码子存在明显的简并和偏倚特性;与其它六种蓝藻以及盐藻、莱茵衣藻和拟南芥进行序列相似性分析,结果节旋藻与同属颤藻门的束毛藻(Trichodesmium erythraeum)WH 9601相似性最高,达73.3[％],与集胞藻(Crocosphaera sp.)WH 8501和丝状蓝藻念珠藻(Nostoc.punctiforme)PCC 73102相似性次之,分别为65.9[％]和59.8[％]。基因的系统发生树显示亲缘关系最近的蓝藻门聚为一类,而其它的几种真核生物聚为一类。硝酸盐转运蛋白基因序列在节旋藻中是首次发现和报道,对于了解节旋藻对氮元素的摄取及转运分子机制奠定了基础。

目录

文摘

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第一章文献综述和立项依据

第二章极大节旋藻大分子量基因组文库及其在重叠群构建中的应用

第三章节旋藻/螺旋藻基因组特性初步分析

第四章硝酸盐转运蛋白基因克隆与序列分析

参考文献

附录1

致谢

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