扇贝多肽对紫外线损伤小鼠胸腺淋巴细胞的保护作用及其机制研究

摘要

扇贝多肽(PCF)是从海洋生物栉孔扇贝(Chlamys farreri)中得到的水溶性多肽。本文首先通过复制小鼠的地塞米松免疫抑制模型，采用免疫组织化学、MTT法和流式细胞仪的方法，探讨扇贝多肽在体内对胸腺细胞和外周血淋巴细胞增殖和分化的作用。在此基础上，通过正交设计实验方案，筛选出适宜的紫外线辐照参数，建立了紫外线对体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的病理模型。实验设计分组为：对照组，紫外线照射模型组，紫外线+O.125％PCF组，紫外线+0.25％PCF组，紫外线+0.5％PCF组和紫外线+0.1％VitC组。通过采用MTT法检测淋巴细胞活性；透射电镜观察细胞超微结构的改变；琼脂糖凝胶电泳观察DNA条带特征性变化；酶生化法测定细胞胞浆内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量以及细胞抗超氧阴离子能力(A-SAC)和总抗氧化能力(T-AOC)；流式细胞仪测定细胞凋亡率；Fluo-3-AM荧光染色测定细胞内游离[ca<'2+>]<,I>的变化；Rhodamine 123荧光染色测定线粒体膜电位(△Ψ<,M>)的改变；免疫细胞化学检测细胞p53、Bcl-2、Bax基因蛋白的表达；PT-PCR检测c-fos mRNA和c-Jun mRNA的表达；原位杂交检测细胞P21 <'wAF1>mRNA、P38 mRNA的基因表达；琼脂糖凝胶电泳观察各组不加入或分别加入ERK抑制剂、JNK抑制剂和P38抑制剂后的DNA ladder的变化；westem-blot检测磷酸化ERK、磷酸化JNK、和磷酸化P38的活性等方法，探讨在紫外线照射下，扇贝多肽(PCF)对小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的保护作用及机制。 实验结果表明，PCF腹腔注射能够明显增强小鼠胸腺淋巴细胞转化能力，并促进DEX处理小鼠外周成熟的淋巴细胞增殖；在紫外线强度为6.16mJ/cm<'2>，照射时间为10秒的照射条件下，建立了紫外线对体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的病理模型；0.125-0.5％浓度范围内的PCF能显著提高小鼠胸腺淋巴细胞的活性，降低淋巴细胞凋亡率，显著提高细胞浆中SOD、GSH-px的活性，降低ROS、MDA含量，提高A-SAC及T-AOC；从而提高小鼠胸腺淋巴细胞清除活性氧和自由基的能力，阻断ROS介导的DNA损伤；PCF能降低淋巴细胞内游离[Ca<'2+>]i；稳定线粒体的膜电位；上调Bcl-2蛋白和下调Bax蛋白的表达，由此阻断DNA损伤介导的线粒体通路的信号转导；PCF抑制细胞P53基因和p21 mRNA凋亡促进基因的活化，从而阻断p21<'WAFL>参与调控的紫外线辐射诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡；PCF可下调小鼠胸腺淋巴细胞p38 mRNA的表达，抑制紫外线辐射所致的的c-los和c-jun的表达，进而抑制JNK通路的凋亡转录因子AP-1的活化而抑制淋巴细胞的凋亡，PCF提高了磷酸化ERKs蛋白的活性，降低磷酸化JNKs和P38蛋白的活性，说明PCF是影响MAPKs家族和凋亡的相关因子，PCF通过调节MAPK的信号转导级联通路实现其部分保护作用。 实验证实，扇贝多肽在体内能提高胸腺淋巴细胞的增殖和转化能力；可提高体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞的活性，抑制紫外线辐射诱导的淋巴细胞凋亡，对紫外线损伤的小鼠胸腺淋巴细胞具有保护作用。其作用机制可能与PCF能清除氧自由基、提高抗氧化酶活性、保护细胞膜相结构、减少DNA断裂及参与调节淋巴细胞凋亡的线粒体通路、P53基因通路和MAPK的信号转导级联通路有关。

目录

论文说明：中英文缩略词表

摘要

文献综述第一章紫外线引起氧化应激与细胞凋亡机制研究进展

第二章抗辐射药物的研究进展

第三章扇贝多肽对小鼠胸腺功能影响的体内研究

第四章扇贝多肽对紫外线损伤小鼠胸腺淋巴细胞作用的研究

第五章扇贝多肽对紫外线损伤淋巴细胞的保护作用的机制研究

总结

参考文献

致谢

文章发表情况