太平洋磷虾胰蛋白酶样酶的分离纯化及其酶学性质研究

摘要

太平洋磷虾(Euphausiapacifica)隶属于节肢动物门甲壳纲，为北太平洋亚北极区的优势种，广泛分布于远东海域、黄海及台湾海峡附近。 磷虾属动物体内的胰蛋白酶样酶具有较高的生物活性和应用价值。目前，国内外学者对太平洋磷虾的研究主要局限于生态学和形态学领域。目前太平洋磷虾主要用作水产动物饵料及添加剂。对其消化酶及消化生理的研究工作尚未展开。因此，对其胰蛋白酶样酶进行分离纯化、性质及动力学研究，具有一定的理论及应用价值。 本文采用55～65％饱和度硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析及SephacrylS200凝胶过滤柱层析获得分子量为3 1.0kDa的胰蛋白酶样酶TLEI；采用85％硫酸铵沉淀、Benzamidine-Sepharose4B亲和柱层析获得分子量为59.6kDa的胰蛋白酶样酶TLEII。 通过研究催化BApNA水解反应的动力学过程，得出TLE I的Km(0.177±0.0185)×10<'-3>mol·L<'-1>；V<,nax>=(7.67±0.686)×10<'-5>mol·L-1·S<'-1>： K<,cat>=0.474S<'-1>；K<,cat>／K<,m>=2.68×10<'3>。 7种抑制剂对酶反应速率影响的实验结果表明：TPCK、PMSF、p-Aminobenzamidine对TLEI表现为轻微的抑制作用，CEOM抑制作用显著，Benzamidine、STI、TLCK表现为强烈的抑制作用，该酶是丝氨酸蛋白酶。通过研究Benzamidine对TLE I的抑制动力学过程，结果表明Benzamidine对TLE I的抑制类型为非竞争性抑制，K<,1>=(6.97±0.824)×10<'-5>mmol·L<'-1>。 8种金属离子对酶反应速率影响的实验结果表明：Hg<'2+>、Pb<'2+>、Zn<'2+>、cu<'2+>对TLEI有一定抑制作用，其中Pb<'2+>和Hg<'2+>对酶活力表现出强烈的抑制，Mg<'2+>和Ca<'2+>对TLEI有一定的激活作用，Ni<'+>对TLE I作用不明显，Mn<'2+>随着浓度的增大对TLEI酶活力表现出先促进后抑制的作用。 温度对酶稳定性影响的实验结果表明：TLEI在低于20℃保持稳定，在高于30℃时不稳定。温度对酶反应速率影响的实验结果表明：在pH8.0，以BApNA为底物的反应体系中，TLEI最适宜反应温度为46<'。>C～48℃：体系中，pH3～1l范围内，TLEI的相对活性呈相邻的两个近似钟形峰的曲线，最适宜反应pH在9～9.3之间。 5种有机溶剂对酶反应速率影响的实验结果表明：乙醇和二甲亚砜在低浓度时对TLEI起激活作用，高浓度下表现为强烈抑制作用；丙三醇、丙酮、甲醛对TLEI有较强的抑制作用。 对胰蛋白酶样酶活性功能基团的研究结果表明：FLEI中，色氨酸残基、组氨酸残基是构成酶活性中心的必需基团，NBS修饰酶的色氨酸残基后，酶活力丧失同时伴随着其紫外吸收光谱特征的改变，修饰精氨酸残基提高了酶的催化效率，精氨酸残基可能是该酶活性中心结合部位的关键基团；赖氨酸的游离ε-氨基与酶活性无关，巯基、氨基、羧基不是太平洋磷虾胰蛋白酶样酶TLEI活性中心的必需功能基团，非“巯基酶”。

目录

文摘

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第一章胰蛋白酶研究进展

第二章太平洋磷虾胰蛋白酶样酶的分离纯化

第三章太平洋磷虾胰蛋白酶样酶动力学及酶学性质研究

结论

参考文献

致谢