抗弧菌中草药的筛选及其活性化合物的分离纯化

摘要

弧菌病是水产养殖鱼类最重要的细菌病之一，其暴发性强，不易控制，每年给水产养殖业造成重大的经济损失。目前细菌性病害的防治主要依靠抗生素及化学药物，不仅污染水体环境，而且对鱼体造成伤害，降低鱼体免疫力，形成恶性循环。而且大量使用抗生素，使耐药性菌株不断出现，使病害更加难以控制。 用乙醇浸渍法提取了53种常见中药有效成分，采用平板扩散法研究了对主要致病鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的抑菌作用，发现金银花、大黄、五倍子、五味子、肉桂、月季花、乌梅、诃子、青果等这九种中药有较强的抑菌活性；进一步研究了这些药物的抑菌谱，除金银花外，五倍子、五味子、肉桂、大黄、月季花、乌梅、诃子、青果对哈维氏弧菌(V.harvayi)、拟态弧菌(V.mimicus)、溶藻胶弧菌(V. alginolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、坎贝氏弧菌(V.campbelli)、费氏弧菌(V.fischeri)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、迟缓爱得德华氏菌(Edwardsilla tarda)均具有不同程度的抗菌活性，其中乌梅，诃子、青果对所测12个菌株均表现抑菌活性；肉桂对拟态弧菌(V.mimicus)表现极强抑菌活性，抑菌圈直径达42mm。 采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析对月季花乙醇粗提液有效抗菌成分进行了分离纯化，得到51mg无色针状结晶。通过质谱(ESI-MS)，核磁共振谱(<'1>H-NMR、<'13>C-NMR、<'13>C-dept)对其结构进行鉴定，根据光谱数据并与文献对照，发现该化合物的相关数据与没食子酸(gallic acid)的一致，通过TLC技术，与标准品对照，最后鉴定该化合物为没食子酸(gallic acid)。 采用平板扩散法，研究了该化合物对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、坎贝氏弧菌、拟态弧菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、肺炎克雷伯菌肺炎亚种(Klebsilla pneumoni aesubsp)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、牛莫拉氏菌(Morascella bovis)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsieiia tarda)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌效果，发现gallic acid特异性抑制哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌，而对所测其它弧菌及非弧菌属不表现活性。采用试管二倍稀释法测定了gallic acid对鳗弧菌(V.anguillarum)CW1的最小抑菌浓度(MIC)，并与常见抗生素卡那霉素(kanamycin)进行了比较研究。结果发现，没食子酸(gallic acid)对鳗弧菌(V. anguillarum)CW1的最小抑菌浓度为25.6μg m<'-1>(1.5×10<'-1>μmolml<'-1>)，而卡那霉素(kanamycin)对鳗弧菌(V.anguillarum)CW1的最小抑菌浓度为51.2μg mL<'-1>(8.6×10<'-2>μmolmL<'-1>)。

目录

声明

第一章文献综述

第二章48株致病性副溶血性弧菌的药敏实验研究及抗弧菌中草药的筛选

1材料与方法

1.2试剂和仪器

1.3中药的选择

1.4粗提液的制备

1.5培养基的制备

1.6 48株副溶血性弧菌的药敏实验研究

1.7 53种中药抑菌活性的测定

1.8中药粗提液抑菌谱的测定

2结果

2.1 48株副溶血性弧菌的药敏实验研究

2.2 53种中草药抑菌效果

2.3中药粗提液抑菌谱结果

3讨论

参考文献

第三章月季花抗弧菌活性化合物的分离纯化及其抑菌活性的测定

1材料与方法

1.1试验菌株

1.2试剂和仪器

1.3月季花粗提液的制备

1.4月季花粗提液抑菌谱的测定

1.5活性化合物的分离纯化

1.6培养基的制备

1.7抑菌纸片的制备

1.8活性化合物结构的鉴定

1.9活性化合物抑菌谱的测定

1.10活性化合物对鳗弧菌(V. anguillarum)CW1的最小抑菌浓度(MIC)

2结果

2.1月季花粗提液抑菌谱的测定

2.2活性化合物的质谱分析

2.3活性化合物的核磁共振分析

2.4活性化合物的TLC鉴别

2.5活性化合物抑菌谱的测定

2.6活性化合物对鳗弧菌(V.anguillarum)CW1的最小抑菌浓度(MIC)

3讨论

参考文献

结论

已接收和发表的文章

致谢