鲢、鳙鱼遗传连锁图谱构建和鳙鱼蛋白感染因子基因克隆

摘要

鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙鱼(Aristichthys nobilis)是中国特有的四大家鱼中的2个重要成员，主要分布在黑龙江、长江和珠江水系。传统人工养殖依靠天然鱼苗。但是，人口增长和人类经济活动使其天然产卵和孵化场消失或遭到破坏。人工育苗技术虽然解决了鱼苗的供应问题，但是不完善的遗传资源管理和使用方法，使这两种鱼的生长表现、抗病抗逆性和遗传多样性都明显降低。另外，因洪水导致的养殖个体逃逸和大规模人工鱼苗放流实践也使天然群体的遗传多样性受到干扰。对这些问题的研究迫切需要一套适用的分子标记。到目前为止还没有这两种鱼的微卫星DNA遗传图谱。 蛋白感染因子(Pmteinaceous infectious agents，prions)，也称朊病毒，是蛋白本质、导致传染性海绵样脑病(transmissible spongiform encephalopathies，TSE)的致病因子，一般指感染因子蛋白(pdon protein，PrP)的凝聚体。养殖鱼类也可能通过饲料蛋白形成鱼类pdon并引发鱼类TSE。 本文以鲢和鳙鱼为研究材料，分离鲢微卫星DNA分子标记、研究鲢鱼的遗传多样性和鲢微卫星DNA标记在鳙鱼中的通用性、构建了鲢、鳙鱼的遗传连锁图谱，另外，还对鳙鱼的蛋白感染因子相关基因进行了克隆与分析，主要结果如下： 利用FIASCO的方法构建了鲢(GT)n的微卫星DNA富集文库，检测结果证明该微卫星DNA文库的富集效率在355左右。测序得到81条含有微卫星DNA的序列的克隆，共得到96个微卫星DNA位点。其中完美的微卫星DNA共68个，占71％；不完美的微卫星DNA共22个，占23％；复合的微卫星DNA有6个，占6％。在这些微卫星DNA位点中，重复单元(CNGT)n有88个，占92％，另外我们还观察到A<,7>、(AG/TC)<,n>、(AT)<,12>、(ATC)<,8>、(TCCA)<,6>等重复序列的微卫星DNA。所得到的微卫星DNA的重复次数在5-103次之间，大部分为10-20次重复，平均重复次数为14.5次。根据分离所得的鲢微卫星DNA位点，设计了67对微卫星DNA标记引物，有44对能够得到特异的扩增产物。利用这些引物对长江流域野生鲢进行遗传多样性分析，结果显示，44个微卫星DNA位点中，有40个为多态性的位点，共得到297个等位形式，各位点分别扩增得到的2-16个等位基因，平均每一个位点的等位基因数目为7.4个。40个多态性位点中，期望杂合度范围为0.07～0.91，平均的期望杂合度为0.69。这些位点显示出较高的多态性。利用这些引物对鳙鱼进行跨物种扩增试验，发现这些引物在鲢和鳙鱼中是通用的，均可以的到扩增产物。 利用拟杂交策略和微卫星DNA和AFLP分子标记，以鲢、鳙鱼杂交亲本及其F1群体为作图群体，应用JoinMap3.0 ，构建了鲢(♂)和鳙鱼(♀)的中等密度遗传连锁图谱。在鲢(♂)图谱中，包含27个连锁群共271个标记(48个SSR和223个AFLP)，总图距为952.2cM，图谱覆盖率为82.8％。鳙鱼(♀)图谱包含30个连锁群共153个标记(27个SSR和126个AFLP)，总图距为852.0cM，图谱覆盖率为80.5％。共有18个微卫星DNA位点为两图谱共有。 利用RT-PCR的方法，从同一个鳙鱼个体脑组织中克隆得到两种形式的蛋白感染因子基因序列。推测的蛋白感染因子蛋白具有明显的PrP结构特点，PrP-1蛋白含有526个氨基酸，分子量约为55kD，pI约为8.9；PrP-2蛋白含有519个氨基酸，分子量约为54.6kD，pI约为9.0。与斑马鱼3种形式的PrP相比较对照，这两种PrP蛋白属于PrP-2型。分子系统学分析显示，在疏水区域淡水鱼之间的同源性较淡水鱼与海水之间的同源性高，淡水鱼与海水鱼的PrP在结构上明显的不同主要表现在重复区域上出现重复肽段的重复次数的减少，据推测，重复片段的功能可能与盐代谢具有相关。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略语

声明

第一章文献综述

1.分子标记概述

2.遗传连锁图谱的构建与应用

3.蛋白感染因子的研究

4研究课题的目的及意义

第二章鲢基因组微卫星DNA的筛选

0.前言

1.材料：

1.1样本来源：

1.2主要试剂：

1.3主要软件

2.实验方法

2.1 DNA提取及浓度测定

2.2小片段基因组文库的构建

2.3鲢微卫星DNA的杂交筛选

2.4连接与转化

2.5含微卫星DNA序列的重组子的筛选

2.6测序与分析

3.实验结果

3.1鲢基因组DNA提取结果

3.2鲢基因组DNA的酶切与连接结果

3.3连接产物的PCR扩增

3.4基因组微卫星DNA的筛选结果

4.讨论

4.1限制性内切酶的选择

4.2探针的选择

4.3杂交条件对筛选结果的影响

4.4微卫星DNA重复数的讨论

4.5其他类型的微卫星DNA

第三章鲢微卫星DNA标记的多态性检测及在鳙鱼中的跨物种扩增

0前言

1.材料

1.1样本来源

1.2主要试剂的配制

1.3主要软件

2实验方法

2.1 DNA的提取及检测

2.2微卫星DNA引物的设计

2.3微卫星DNA引物的溶解

2.4微卫星DNA引物扩增条件的摸索

2.5微卫星DNA扩增多态性的检测

2.6数据统计及分析

3实验结果

3.1微卫星DNA引物设计的结果

3.2引物扩增条件摸索的结果

3.3微卫星DNA在野生鲢的多态性检测的结果

3.4鲢(Hypophthalmichthys molitrix)微卫星DNA在鳙鱼(Aristichthys nobilis)中的扩增结果

4讨论

4.1关于引物设计的讨论

4.2 Mg2+浓度对PCR反应的影响

4.3部分引物不能得到扩增产物的原因

4.4无效等位基因(Null Allele)

4.5微卫星DNA标记遗传学参数的选取及意义

4.6微卫星DNA跨物种扩增

第四章鲢、鳙鱼遗传图谱的构建

0引言

1.材料

1.1样本来源：

1.2主要试剂：

1.3主要软件：

2.实验方法

2.1 DNA提取及浓度测定

2.2 AFLP分析

2.3 SSR分析

2.4连锁图谱的构建

3.实验结果

3.1 AFLP扩增结果

3.2 SSR扩增结果

3.3鲢×鳙鱼遗传图谱的构建

3.4基因组长度及图谱覆盖率

4讨论

4.1拟测交策略

4.2异常分离位点

4.3雌雄图谱及其比较

第五章鳙鱼蛋白感染因子基因的克隆与分析

0前言

1实验材料

1.1样本来源：

1.2主要试剂：

1.3主要软件：

2.实验方法

2.1总RNA的提取及检测

2.2鳙鱼PrP基因中间片断的克隆

2.3 PrP cDNA的3' RACE

2.4 PrP cDNA的5' RACE

2.5序列的拼接

2.6数据分析

3.实验结果

3.1 RNA提取结果

3.2鳙鱼PrP基因的全序列

3.3鳙鱼PrP的结构分析

3.4鳙鱼PrP的系统学分析

4.讨论

4.1 PrP基因的克隆方法

4.2鱼类PrP相关分析

4.3养殖鱼类感染Prion的风险性分析

结论

参考文献

在读期间发表的文章和提交的论文

致谢