海洋琼胶降解细菌的多样性研究与Agarivorans albus QM38 β-琼胶酶基因的克隆与表达

摘要

对青岛近海海水中琼胶降解细菌进行了系统的分离，筛选得到87株海洋琼胶降解细菌。从中选出15株有代表性的菌株，克隆其16SrDNA序列，进行分子鉴定。结果表明，这些细菌主要分布在Cellulophaga，Cytophaga，Microbulbifer，Glaciecola，Pseudoalteromonas，Pseudomonas，Alteromonas和Agarivorans共8个属中。其中QM5，QM21，QM36鉴定为Cellulophaga lytica，QMl5和QM28鉴定为Glaciecola mesophila，QM11，QM35，QM47，QM65分别鉴定为Cytophaga fucicola，Pseudoalteromonas atlantica，Pseudoalteromonas haloplanktis，Alteromonas addita。其余5株菌能够鉴定到属的水平。 对细菌QM42和DH166的鉴定结果表明，这两株细菌都是革兰氏阴性的杆状细菌，生长需要NaCl，说明它们都是海洋细菌。QM42细胞宽度为0．6-0．7μm，长度为1．5-2．5μm，不产生芽孢。它能够产生氨肽酶、氧化酶和接触酶，并且能够利用下列糖类产酸：葡萄糖、木糖、乳糖和纤维二糖。细菌DH166是从东海中部海区50米深度的水样中分离到的一株海洋细菌。其生长对于营养条件的要求比较苛刻，培养基中没有丰富的有机物，它不能够生长。在1％和6％的NaCl含量的条件下都不能生长。对这两株细菌进行了脂肪酸分析和16SrDNA序列分析。初步鉴定QM42属于一个潜在的新种，而且可能是一个新属，与Marinobacter，Microbulblyer和Alcanivorax等属相近。细菌DH166属于Pseudoalteromonas属的一个潜在的新种。 对细菌QM38进行了进一步的研究。通过形态观察，生理生化特征鉴定以及16SrDNA序列分析，鉴定细菌QM38为Agarivorans albus。初步研究了细菌QM38琼胶酶摇瓶发酵的条件，对其产生的琼胶酶粗酶液进行了分析，研究了底物浓度和pH对酶活力的影响并分析了其酶解产物。 根据已经发表的其他细菌的琼胶酶的基因序列设计引物，从Agarivorans albus QM38的基因组DNA中克隆得到了三条编码琼胶酶的基因agaD01、agaD02和agaD03，并进行了测序。其中两条基因，agaD02和agaD03在Agarivorans属的细菌中是首次被克隆和测序。agaD01和agaD02在GenBank中的收录号分别为EF051475和EF199908。序列分析的结果表明，在GertBznk数据库中，共有三条序列与agaD01有相似性，分别是来自弧菌JT0107编码β-琼胶酶的agaA基因，序列号为D14721，相似性有97.8％；Agarivorans sp.JA-1编码β-琼胶酶的基因，序列号为EF100136，相似性有98.9％；Agarivorans sp.JAMB-A11编码琼胶酶agaA11的基因，序列号为EF100136，相似性有98.2％。和其他序列则基本上没有相似性。与agaD02有相似性的只有一条序列，就是弧菌JT0107编码β-琼胶酶的agaB基因，序列号为D21202。这两条基因相似性有98.8％。在GenBank数据库中，只有两条序列与agaD03有相似性，一条是弧菌PO-303编码β-琼胶酶agarase-c的基因，序列号为AB218419，这两条基因相似性有96.8％。另外一条是Pseudoalteromonas sp.CY24编码胞外琼胶酶的基因，序列号为AY293310，这两条基因相似性有96.5％。但是agaD03和数据库中的其他基因基本上没有任何的同源性。对agaD01和agaD02编码的蛋白质产物进行了生物信息学分析，结果显示，对这两个蛋白及其同源蛋白的结构和功能的研究很少，如果能进行结构与功能的研究，得到其催化特性，将能够获得许多新的数据与材料。 设计带有酶切位点的引物扩增细菌QM38的agaD02基因，产物克隆到载体pMD19-T。Simple，经过酶切及测序验证后，将此基因亚克隆到原核表达载体pET24a，构建表达载体pET24a-agaD02，转化大肠杆菌BL21，提取质粒，双酶切进行验证。利用IPTG诱导表达，通过对诱导表达后的菌落进行碘液染色，发现有透明区域，证明表达成功而且有琼胶酶分泌到细胞外。 利用硫酸铵沉淀、分子筛层析和离子交换层析等方法，从Agarivorans albusQM38的培养液上清中分离纯化出一个琼胶酶组分。经SDS-PAGE电泳显示为单一条带，测定其分子量为44.2kD。根据其分子量推断，此琼胶酶组分可能是agaD03基因的编码产物。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1琼胶酶的分类及酶活测定

2琼胶酶的来源

3 β-琼胶酶及其酶学性质

4 α-琼胶酶及其酶学性质

5琼胶酶的分子生物学研究

6琼胶酶的晶体结构及蛋白质结构与功能的预测

7琼胶酶在糖苷水解酶家族中的分类及作用机理

8琼胶酶的应用

第二章青岛近海琼胶降解细菌的筛选和多样性分析

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第三章两株海洋琼胶降解细菌的鉴定

1材料与方法

2实验结果

3讨论

第四章海洋琼胶降解细菌Agarivorans albus QM38的鉴定与粗酶液性质

1材料和方法

2结果与讨论

第五章Agarivorans albus QM38琼胶酶基因agaD01的克隆与序列特征分析

1材料和方法

2实验结果

3讨论

第六章Agarivorans albus QM38琼胶酶基因agaD02的克隆与序列特征

1材料与方法

2实验结果

3讨论

第七章Agarivorans albus QM38琼胶酶基因agaD02的表达

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第八章Agarivorans albus QM38 agaD03基因的克隆与一个琼胶酶组分AgaC的分离纯化

1材料与方法

2实验结果及分析

3讨论

第九章工作总结与展望

9.1本论文的工作总结与创新点

9.2今后尚待进行的进一步工作

参考文献

攻读博士期间发表的论文目录

致谢