鳗弧菌金属蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化、定点突变及其DNA疫苗的研制

摘要

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)能引起世界范围内的淡水、海水鱼类及其它养殖动物发病，其病症为快速的爆发性败血症及组织损伤，病鱼在短期内死亡，常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌W-1分离自山东莱州湾海区发病的鲈鱼，已有的研究表明，W-1胞外金属蛋白酶是其重要的毒力因子之一，在细菌致病过程中发挥了重要的作用。编码金属蛋白酶的empA基因已被克隆和测序。 本研究将鳗弧菌w一1金属蛋白酶基因empA分别克隆到原核表达载体pBV220、pBAD24和pET24d(+)中，得到的三种重组质粒分别转化大肠杆菌JMl09、TOP10和BL21(DE3)。比较empA基因在三种重组菌JM109/pBV220/empA、TOP10/pBAD24/empA和BL21(DE3)/pET24d(+)/empA中的表达情况，最终选择重组菌BL21(DE3)/pET24d(+)/empA来表达、纯化及定点突变研究empA基因。对重组菌培养及诱导条件进行优化后发现，25℃时经1 mM IPTG诱导重组菌体表达的EmpA金属蛋白酶可溶性蛋白表达量最多、包涵体形成最少，并且分泌到培养上清液中的EmpA金属蛋白酶量也最大；Western-blot检测重组表达的EmpA金属蛋白酶具有抗原性。进一步用Ni亲合柱从重组菌菌体及其培养上清液中纯化了EmpA金属蛋白酶，SDS-PAGE电泳测得分子量都为36 kDa，而未经加热处理的蛋白分子量为44.6 kDa；用Sephadex G-200测得蛋白分子量都为44.6 kDa，表明在大肠杆菌中表达的EmpA金属蛋白酶为单体蛋白。纯化的EmpA金属蛋白酶对牙鲆鳃细胞系(FG)有毒性作用，用5μg的蛋白作用于FG，在12 h内即可观察到细胞的死亡；酶对大菱鲆也表现出致死毒性，其症状与感染鳗弧菌的病鱼症状相似，半致死剂量LD<,50>为8.1μg/鱼。 利用PCR方法对推测的EmpA金属蛋白酶活性位点氨基酸的碱基序列进行了定点突变，将突变质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，并用Ni亲合柱分别纯化了各突变蛋白。比较EmpA金属蛋白酶及其突变蛋白的蛋白水解活性和细胞毒性发现，突变蛋白都不同程度地丧失了其蛋白水解活性和细胞毒性，表明突变位点的氨基酸对酶活性起着十分重要的作用。将没有蛋白水解活性和细胞毒性的m-EmpA7蛋白的基因序列m-empA7克隆到真核表达载体pEGFP-N1中，得到真核重组表达质粒pEGFP-N1/m-empA7。用磷酸钙共沉淀法将重组质粒转染至CHO和HEK293T细胞中，通过荧光显微镜、RT-PCR检测和Western-blot检测证实目的基因在真核细胞内获得了表达。 对牙鲆肌肉注射50μg/尾的重组质粒pEGFP-N1/m-empA7，于接种后不同时间分别取对照组和试验组牙鲆各组织做冷冻切片，在荧光显微镜下观察可见，在试验组牙鲆的注射点周边肌肉、注射点对面体侧肌肉、脾脏、前肾、体肾、后肠、心、鳃和肝脏等部位均可见绿色荧光，对照组组织没有荧光。RT-PCR检测和Western-blot检测的结果也证实目的基因在牙鲆体内获得了表达。 为研究真核重组表达质粒pEGFP-N1/m-empA7对牙鲆的免疫效果，分别以5μg/尾、20 μg/尾和50 μg/尾的不同剂量对牙鲆进行肌肉注射免疫，同时设置注射PBS和空质粒的对照组。ELISA检测结果显示，各免疫组牙鲆体内均产生了抗m-EmpA7抗原的特异性抗体，且抗体水平随接种剂量的增加而升高；而对照组牙鲆血清基本没有抗体凝集发生，在不同时间内抗体水平无明显变化。免疫后第5周，用鳗弧菌W-1对各组进行攻毒实验，各免疫组的免疫保护率(RPS)分别为57.1％，71.4％和85.7％，与对照组相比，免疫组产生了显著的保护作用(p<0.001)。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1鱼类的细菌性疾病

2鱼类病原鳗弧菌

2.1流行病学

2.2致病机制与毒力决定因子

3弧菌胞外蛋白酶及其作用

3.1胞外蛋白酶的种类和理化性质

3.2弧菌胞外蛋白酶的基因结构及特点

3.3弧菌胞外蛋白酶的体内作用机制

4基因体外定点突变技术

4.1寡核苷酸引物介导的定点突变

4.2 PCR介导的定点突变法及其改进——大引物突变法

4.3盒式突变

4.4三种方法的优缺点比较

5鱼类DNA疫苗的研究进展

5.1质粒的构建

5.2鱼类DNA疫苗的接种方法

5.3外源基因在鱼体内表达的检测

5.4 DNA疫苗的免疫效果

5.5 DNA疫苗可能的免疫机制

5.6鱼类DNA疫苗存在的问题

6本论文研究的目的和意义

1材料与方法

1.1菌株和质粒

1.2实验动物

1.3细胞系

1.4培养基

1.5试剂及仪器

1.5.1试剂

1.5.2仪器

1.6鳗弧菌金属蛋白酶基因empA的原核表达

1.6.1原核表达质粒的构建及鉴定

1.6.2金属蛋白酶基因empA在大肠杆菌中的表达

1.7重组EmpA金属蛋白酶的纯化

1.7.1重组菌BL21(DE3)/pET24d(+)/empA的诱导及培养

1.7.2从菌体中纯化EmpA金属蛋白酶

1.7.3从培养上清液中纯化EmpA金属蛋白酶

1.7.4 Ni琼脂糖亲和柱亲和层析

1.7.5 Ni琼脂糖亲和柱的处理与再生

1.8重组EmpA金属蛋白酶的性质研究

1.8.1菌体中和分泌到上清液中的EmpA金属蛋白酶的分子量测定

1.8.2菌体中和分泌到上清液中的EmpA金属蛋白酶蛋白水解活力的测定

1.9重组EmpA金属蛋白酶的细胞毒性及致病性

1.9.1 EmpA金属蛋白酶对牙鲆鳃细胞系(FG)的细胞毒性

1.9.2 EmpA金属蛋白酶对大菱鲆的致病性

1.10 PCR定点突变研究金属蛋白酶EmpA的活性位点

1.10.1以pET24d(+)/empA质粒为模板的定点突变

1.10.2突变的金属蛋白酶基因m-empAs在大肠杆菌中的表达

1.10.3突变的金属蛋白酶基因m-empAs的纯化

1.10.4突变的金属蛋白酶基因m-empAs蛋白水解活性的测定

1.10.5突变的金属蛋白酶基因m-empAs对牙鲆鳃细胞系（FG）的细胞毒性

1.11突变的金属蛋白酶基因m-empA7的真核表达

1.11.1突变的金属蛋白酶基因m-empA7真核重组表达质粒的构建及鉴定

1.11.2真核细胞转染及表达产物的检测

1.12真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7在牙鲆体内的表达及表达产物的检测

1.12.1真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7的大量提取

1.12.2提取的重组质粒的浓度和纯度检测

1.12.3实验动物处理及免疫

1.12.4真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7在牙鲆体内表达产物的检测

1.13真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7对牙鲆免疫效果的研究

1.13.1真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7的大量提取

1.13.2提取的重组质粒的浓度和纯度检测

1.13.3实验动物处理及免疫

1.13.4免疫牙鲆血清中抗体水平测定

1.13.5真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7对牙鲆的免疫保护效果

2结果与分析

2.1金属蛋白酶基因empA在大肠杆菌中的表达

2.1.1原核表达质粒的构建及鉴定

2.1.2金属蛋白酶基因empA在大肠杆菌中的表达

2.1.3表达条件的优化

2.1.4重组菌表达产物的蛋白水解活性测定

2.2重组EmpA金属蛋白酶的纯化

2.2.1从菌体中纯化重组EmpA金属蛋白酶

2.2.2从培养上清液中纯化EmpA金属蛋白酶

2.2.3菌体中和分泌到培养上清液中EmpA金属蛋白酶分子量的测定

2.3重组EmpA金属蛋白酶的细胞毒性及致病性

2.3.1 EmpA金属蛋白酶对牙鲆鳃细胞系(FG)的细胞毒性

2.3.2 EmpA金属蛋白酶对大菱鲆的致病性

2.4 PCR定点突变研究金属蛋白酶EmpA的活性位点

2.4.1以pET24d(+)/empA质粒为模板的定点突变

2.4.2突变的金属蛋白酶基因m-empAs在大肠杆菌中的表达

2.4.3突变的m-EmpAs金属蛋白酶的纯化

2.4.4突变对EmpA金属蛋白酶蛋白水解活性的影响

2.4.5突变对EmpA金属蛋白酶细胞毒性的影响

2.5突变的金属蛋白酶基因m-empA7在真核细胞中的表达

2.5.1 pEGFP-N1/m-empA7真核重组表达质粒的构建及鉴定

2.5.2提取的重组质粒的浓度和纯度检测

2.5.3 pEGFP-N1/m-empA7真核表达质粒在真核细胞中的表达

2.6突变的金属蛋白酶基因m-empA7在牙鲆体内的表达

2.6.1提取的重组质粒的浓度和纯度检测

2.6.2 pEGFP-N1/m-empA7真核表达质粒在牙鲆体内的表达

2.7真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7对牙鲆的免疫效果研究

2.7.1提取的重组质粒的纯度检测

2.7.2免疫牙鲆血清中特异性抗体水平的变化

2.7.3真核表达质粒pEGFP-N1/m-empA7对牙鲆的免疫保护效果

3讨论

4结论

参考文献

附录

致谢