浮游生物传播对虾白斑综合症病毒（WSSV）的研究

摘要

本文研究的目的就是检验浮游生物是否可以成为对虾白斑综合症的传播媒介并研究其传播机制。 以对虾养殖池塘中常见的湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)、亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、盐藻(Dunaliella salina)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum)四种浮游微藻为实验对象，在与病毒粗提液混合后0．5、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168h采样，每个实验三个重复，研究其对WSSV的携带和传播。研究结果表明，这四种微藻和WSSV病毒粗提液混合后，经PCR检测发现，在混合后96 h内微藻都可以携带WSSV，其中湛江等鞭金藻和亚心形扁藻在144 h内为WSSV阳性，盐藻在120 h内为阳性，然后在不同时间之后呈现WSSV阴性，这说明浮游微藻可以携带WSSV。 通过病毒—浮游微藻吸附法对对虾池塘中三种常见浮游动物——壶状臂尾轮虫．Brachionus urceus、克氏纺锤水蚤Acartia clausi和黑褐新糠虾Neomysisawatschensis进行了WSSV的感染实验，实验分对照、浸泡法和病毒—浮游微藻吸附法攻毒组三个处理，每个处理三个重复。套式PCR检测结果表明，对照组和浸泡法攻毒组中的三种浮游动物均为病毒阴性，而病毒—浮游微藻吸附法则使WSSV成功感染这些浮游动物，攻毒组中三个重复的检测结果均为阳性，从而找到了一种新的浮游动物感染WSSV的方法；同时表明，微藻可以传播WSSV。 采用病毒一浮游微藻吸附法使WSSV感染壶状臂尾轮虫，然后刺激其产生休眠卵，每个处理三个重复，套式PCR检测结果表明，轮虫的休眠卵和由此孵化出的幼体也为WSSV阳性，这表明，轮虫可以通过水平和垂直两种途径感染上WSSV。用WSSV阳性的轮虫投喂中国明对虾Fenneropenaeus chinensis第Ⅲ期蚤状幼体(ZⅢ)，每个处理十个重复。实验表明，虽然幼体没有出现严重死亡，对照组的死亡率(34.67±15.11％)和攻毒组(39.47±15.44％)差异性也不显著(P>0.05)；但是幼体的生长和变态却受到很大的影响，变态率(19.26士5.4％)与对照组(74.22±10.18％)相比差异显著(P<0.01)。经套式PCR检测表明，攻毒组中40％的对虾幼体为WSSV阳性，而对照组全为阴性。由此证明，轮虫可以成为WSSV传播中的媒介。通过套式PCR检测发现，环胶州湾对虾养殖池塘底泥分离出的150份桡足类休眠卵中14.67％为WSSV阳性。由这些休眠卵孵化而来的幼体中6％为病毒阳性，但是，从WSSV阳性休眠卵孵化而来的幼体病毒阳性率却高达36.37％。运用病毒一浮游微藻吸附法对桡足类的哲水蚤类Acartia sp.进行WSSV攻毒实验，套式PCR检测结果发现，攻毒组三个重复中的哲水蚤均为WSSV阳性，其所产的休眠卵以及由此孵化而来的哲水蚤幼体也为病毒阳性，而对照组中的哲水蚤成体、休眠卵和幼体均为阴性。这表明，桡足类也可以通过水平和垂直两种途径感染WSSV。 通过病毒-浮游微藻吸附法使桡足类美丽猛水蚤Nitocra sp.感染上WSSV，然后用这些病毒阳性猛水蚤投喂日本囊对虾Marsupenaeus japonicus的仔虾，每个处理四个重复，经过15天的投喂，攻毒组(PCO)仔虾的感染率是100％，死亡率是52.50±5.00％，投喂WSSV阴性猛水蚤对照组(NCO)的死亡率是20.00士0.00％，两组相比差异显著(P<0.05)。为了确认WSSV阳性猛水蚤体内病毒的感染性，本实验还用病毒阳性猛水蚤的组织粗提液注射日本囊对虾稚虾，每个处理四个重复，攻毒20天后，对虾的死亡率是72.50±9.57％；一步.PCR检测攻毒组的稚虾全部为病毒阳性，而注射病毒阴性猛水蚤组织粗提液稚虾的死亡率是22.50±5.00％，显著低于攻毒组(P<0.05)；并且套式PCR检测该组对虾为阴性。本研究结果证明，猛水蚤可以作为WSSV的宿主而保持病毒的感染力，并成为病毒的传播媒介。 利用病毒-浮游微藻吸附法使不同发育阶段的卤虫感染WSSV，运用RT-PCR方法，以WSSV囊膜蛋白VP28的特异引物检测WSSV阳性的不同发育阶段卤虫，发现WSSV没有在卤虫体内复制，由此推断，卤虫可能只是WSSV的物理携带者，不是生物携带者或宿主。用感染WSSV的卤虫投喂实验动物，以检验卤虫传播WSSV的能力，同时尝试了寻找新的实验动物来代替对虾仔虾用于WSSV相关的实验。黑褐新糠虾Neomysis awatschensis和凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei仔虾摄食WSSV阳性的卤虫15天后，经套式PCR可以检测出均呈现WSSV阳性；而摄食WSSV阴性卤虫的实验动物呈现WSSV阴性。但是，摄食卤虫的实验动物死亡率没有显著性差异(P>0.05)。这些结果说明，卤虫作为WSSV的物理携带者，可以通过食物途径传播病毒。另外，黑褐新糠虾和凡纳滨对虾仔虾摄食WSSV阳性中国明对虾肉糜后，全部死亡，套式PCR结果也为阳性。由此说明黑褐新糠虾是WSSV的一种易感动物，可以作为对虾仔虾的替代而用于WSSV的实验，充当实验动物。

目录

文摘

英文文摘

声明

0前言

1综述

1.1病原

1.1.1病原的命名

1.1.2 WSSV的大小和形态结构

1.1.3分类地位

1.1.4环境因子及理化因子对病原感染力的影响

1.2流行病学

1.2.1易感动物

1.2.2宿主

1.2.3传播途径

1.2.4发病时间

1.2.5发病对虾的规格

1.2.6 WSSV暴发流行的影响因素

1.3发病机理

1.3.1 血细胞变化

1.3.2 血清学变化

1.3.3溶解氧下降

1.4症状

1.5病理变化

1.5.1组织学变化

1.5.2 WSSV的靶器官

1.5.3 WSSV的在体内感染顺序

1.5.4白斑的形状、成分及形成

1.6诊断

1.6.1病理学检测

1.6.2免疫学检测技术

1.6.3基因组检测技术

1.7 WSSV的防治对策

1.7.1采用适宜的养殖模式，优化和改善养殖环境

1.7.2消灭或控制病原体，阻断传播途径

1.7.3提高对虾的抗病力

1.7.4运用中草药防治WSSV的展望

参考文献

2病毒－浮游微藻吸附法：对虾白斑综合症病毒(WSSV)感染浮游动物的方式

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1实验动物

2.2.2病毒粗提液的制备

2.2.3 WSSV攻毒实验

2.2.4检测方法

2.2.5 DNA提取

2.3结果和讨论

2.3.1实验用灭菌海水、湛江等鞭金藻、亚心形扁藻、混合液Ⅰ(含病毒粗提液和湛江等鞭金藻)、混合液Ⅱ(含病毒粗提液和亚心形扁藻)以及浸泡组的海水中的WSSV的检测

2.3.2浮游动物中WSSV的检测

2.3.3病毒－浮游微藻吸附法攻毒成功的原因探讨

3浮游微藻携带和传播对虾白斑综合症病病毒(WSSV)的研究

3.1前言

3.2材料和方法

3.2.1实验材料

3.2.2病毒粗提液的制备

3.2.3浮游微藻携带WSSV的实验

3.2.4美丽猛水蚤通过滤食微藻感染WSSV的实验

3.2.5检测方法

3.2.6 DNA提取

3.3结果和讨论

4轮虫在对虾白斑综合症病病毒(WSSV)传播中的作用

4.1前言

4.2材料和方法

4.2.1实验动物

4.2.2病毒粗提液的制备

4.2.3感染攻毒试验

4.2.4检测手段

4.2.5 DNA提取

4.3结果

4.3.1检测轮虫中的WSSV

4.3.2检测轮虫休眠卵和幼体中的WSSV

4.3.3中国明对虾幼体感染WSSV实验

4.4讨论

5桡足类休眠卵和幼体携带对虾白斑综合症病毒（WSSV）的调查和研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1样品采集

5.2.2休眠卵的分离，孵化以及采样固定

5.2.3哲水蚤感染WSSV实验

5.2.4 DNA提取

5.2.5检测方法

5.3结果与讨论

6美丽猛水蚤(Nitocra sp.)作为对虾白斑综合症病毒(WSSV)传播媒介的研究

6.1前言

6.2材料和方法

6.2.1实验动物

6.2.2病毒粗提液的制备

6.2.3攻毒实验

6.2.4 WSSV感染的分子方法诊断

6.2.5 DNA提取

6.3结果

6.3.1对美丽猛水蚤进行WSSV攻毒感染的检测结果

6.3.2通过投喂WSSV阳性猛水蚤对日本囊对虾仔虾进行攻毒实验的结果

6.3.3通过注射WSSV阳性猛水蚤组织粗提液对日本囊对虾稚虾进行攻毒实验的结果

6.4讨论

7卤虫在对虾白斑综合症病毒(WSSV)传播中的作用研究

7.1前言

7.2材料与方法

7.3结果

7.3.1卤虫攻毒的检测

7.3.2 RT-PCR检测

7.3.3 WSSV人工感染黑褐新糠虾和凡纳滨对虾仔虾的情况

7.4 讨论

参考文献

博士研究生期间科研活动及成果

致谢