养殖大菱鲆病原菌迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及快速检测技术的建立

摘要

大菱鲆(Scophthalmus maximus L)是一个经济价值很高的养殖品种，它生长迅速并且味道十分鲜美，从而深受人们的喜爱。自从20世纪90年代从欧洲引入中国后，大菱鲆的养殖得到了很快的发展。然而，随着养殖环境的不断恶化，使得大菱鲆的细菌性疾病不断发生。爱德华氏菌病(edwardsiellosis)就是经常发生的一种。 爱德华氏菌病是由迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)引起的。迟缓爱德华氏菌，也被记为迟钝爱德华氏菌或缓慢爱德华氏菌，属肠杆菌科，是我国水产养殖中极具危害性的病原菌。在鱼类中，迟缓爱德华氏菌有着广谱的宿主范围，能够感染多种淡水和海水鱼类，包括牙鲆、鳗鲡、真鲷、虹鳟、鲻鱼和罗非鱼等，其感染造成鱼类出血性败血症以及内脏组织的坏死等病症，最终导致患鱼死亡，统称为爱德华氏菌病。另外，迟缓爱德华氏菌还可感染鸟类、哺乳动物及爬行动物等；也有造成人类胃和肠道感染的报道。 2006年夏季和秋季，山东省胶南和昌邑一带的许多海水养殖场养殖大菱鲆发生暴发性传染病，肉眼能观察到的症状为眼睛肿胀、有炎症、有出血点、有腹水和粘性液体。经分离得到一株致病菌，命名为LTB-4。病原菌的主要特征是：革兰氏染色阴性，短棒状，大小(0.5～0.9)×(1.0～2.0)μm，无鞭毛，吲哚、硫化氢、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和葡萄糖阳性，VP反应阴性，不能利用丙二酸、蔗糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖和蜜二糖。腹腔注射大菱鲆的半数致死量为3×103 cfu/mL。16Sr DNA序列比对和构建进化树表明LXB-4与迟缓爱德华氏菌相似度最高。结合其他的鉴定手段包括形态观察、生理生化指标，判定这株菌为鞭毛缺失型迟缓爱德华氏菌。这是国内首次报道鞭毛缺失型迟缓爱德华氏菌。使用gyrB基因的通用引物扩增了LTB-4和ET2034(迟缓爱德华氏菌标准菌株)的部分片段并测序，通过比对设计迟缓爱德华氏菌gyrB基因的特异性引物。PCR结果表明可以在3h内结束，除了迟缓爱德华氏菌LTB-4和ET2034能扩增出特异性片段，其他对照菌株都为阴性：PCR的检测阈值是4.0×104 cfu/mL。用迟缓爱德华氏菌WY28作为抗原，免疫新西兰兔，获得效价为1:2048的多克隆抗体；以此多克隆抗体作为一抗，山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗，建立迟缓爱德华氏菌的间接ELISA快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为106 cfu/mL和1:10000；酶标二抗的最适工作浓度为1:1000。将该方法标准化后进行检测实验，交叉实验结果表明，此多克隆抗体与肠杆菌科的其它菌株交叉反应结果为阴性。研究结果表明，本研究建立的间接ELISA技术在6h内即可检测出浓度为105 cfu/mL的迟缓爱德华氏菌，且与所检测的其它菌株均无交叉反应。 本论文在国内首次报道了大菱鲆病原菌，鞭毛缺失型迟缓爱德华氏菌，并建立了两种迟缓爱德华氏菌的快速检测方法，为大菱鲆爱德华氏菌病的研究和防治提供了基础和保障。

目录

文摘

英文文摘

声明

0前言

0.1我国大菱鲆的养殖概况

0.2大菱鲆疾病研究概况

0.2.1国外大菱鲆疾病的研究概况

0.2.2国内养殖大菱鲆细菌性疾病

0.3鱼类细菌病的诊断及病原菌的鉴定技术

0.3.1表型快速鉴定技术——选择性培养基

0.3.2血清学快速检测技术

0.3.3分子生物学检测技术趋势

0.3.4快速细菌鉴定的方法

0.4迟缓爱德华氏菌的研究概况

0.4.1迟缓爱德华氏菌的主要特征

0.4.2迟缓爱德华氏菌的分类地位

0.4.3迟缓爱德华氏菌的宿主种类

0.4.4对迟缓爱德华氏菌致病性的研究

0.4.5检测手段

0.5本论文研究的目的和意义

1大菱鲆病原菌—迟缓爱德华氏菌的分离及鉴定

1.1材料和方法

1.1.1培养基

1.1.2病鱼检验

1.1.3细菌分离培养与纯培养

1.1.4人工感染试验

1.1.5生理生化鉴定

1.1.6 16S rDNA序列分析

1.6.4 PCR产物的连接转化克隆

1.1.7菌种的归类判定

1.2结果

1.2.1患病大菱鲆的临床表现

1.2.2形态学观察结果

1.2.3生理生化测试结果

1.2.4感染试验结果

1.2.5 16S rDNA进化树构建

1.2.6菌种鉴定结果

1.3讨论

2利用gyrB基因快速检测迟缓爱德华氏菌方法的建立

2.1材料和仪器

2.1.1菌株

2.1.2试剂和仪器

2.2实验方法

2.2.1模板DNA的制备(见1.1.6.1)

2.2.2迟缓爱德华氏菌gyrB基因特异性引物设计和扩增

2.2.3敏感性试验

2.2.4海水养殖病鱼中迟缓爱德华氏菌检测

2.2.5 PCR检测结果16S rDNA测序验证

2.3结果

2.3.1迟缓爱德华氏菌gyrB基因及与其他菌株gyrB基因的比较

2.3.2特异性试验

2.3.3敏感性试验

2.3.4海水养殖病鱼中迟缓爱德华氏菌检测

2.3.5对PCR检测出的迟缓爱德华氏菌用16S rDNA测序验证

2.4讨论

3迟缓爱德华氏菌间接ELISA快速检测方法的研究

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2迟缓爱德华氏菌的制备和灭活

3.1.3免疫血清制备

3.1.4 ELISA方法的建立

3.2结果

3.2.1迟缓爱德华氏菌的免疫血清制备

3.2.2 ELISA检测方法的标准化

3.3讨论

4总结

4.1全文总结

4.2主要创新点

参考文献

附录溶液配方

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果