海洋酵母Kodamaea ohmeri BG3植酸酶的生产、分离纯化、基因克隆及表达的研究

摘要

采用单因子试验和表面响应的方法相结合，对产植酸酶培养基组分及条件进行了优化，结果如下：燕麦1.0％(w/v)，葡萄糖2.0％(w/v)，硫酸铵2.3％(w/v)氯化钠2.0％(w/v)，初始pH6.3，培养温度28℃，培养72h植酸酶的产量达到最高575.5 U/mL，这同软件预测的569.16 U/mL基本相一致。 K.ohmeri BG3胞外植酸酶酶通过分子筛SephadexTM G-75和阴离子交换层析柱DEAE Fast Flow分离纯化，纯化倍数和回收率分别为7.2和10.4％。纯化后植酸酶SDS-PAGE凝胶电泳显示分子量约为98.2 kDa。纯化酶的最适反应pH和最适反应温度分别为5.0和65℃，该酶的温度稳定性较好，在pH3-9范围内稳定性也较好。Mn2+、Ca2+、 Mg2+、Li+、K+、Na+、Ba2+和CO2+在浓度5.0mM时对纯化植酸酶有激活作用；而zn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Ag+、 Cu2+在浓度5.0 mM时，对纯化的植酸酶有抑止作用。纯化的植酸酶活性被Phenylgloxal hydrate强烈抑制，因此分离纯化的植酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶。纯化的植酸酶对底物植酸的动力学常数Km值和Vmax分别是1.45 mM和0.083 mM/min。 用简并引物法扩增了编码海洋酵母K.ohmeri BG3植酸酶的部分基因，片段长度为1023 bp，NCBI登录号为EU009483。用RACE的方法扩增出了海洋酵母ohmer BG3植酸酶基因5′和3′两端的区域，推导出了该植酸酶基因ORF框，共为1389 bp(NCBI登录号：EU082006)。通过比对海洋酵母K.ohmeri BG3植酸酶的基因序列和cDNA序列，发现两者完全一致，说明该基因没有内含子。K.ohmeri BG3植酸酶基因中含有两个酸性磷酸酶所特有的保守区域RHGXRXP和HD区域，这也说明该植酸酶属于酸性磷酸酶家族的一员。根据基因推导出K.ohmeri BG3植酸酶的氨基酸序列，共462个氨基酸，分子量为51.9 kDa。有一段含有15个氨基酸的信号肽，有6个糖基化位点。分析了K ohmeri BG3植酸酶的氨基酸序列与其他植酸酶氨基酸序列的同源性，发现其与C.albicans(xP_713452)和P.stipitis XP 001385108)植酸酶亲缘关系最近，同源性分别为61％和58％。 利用pET表达系统成功实现了植酸酶基因PHYI在大肠杆菌中的表达，重组蛋白部分以活性蛋白形式存在，而大部分以包涵体形式存在。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为51 kDa。重组酶的最适反应pH和最适反应温度分别为5.0和65℃，该酶的热稳定性较好，在pH 3-8范围内稳定性也较好。重组酶在较短时间内可以将植酸水解为不同大小的水解产物，但不能将植酸彻底水解为肌醇。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1植酸及其性质

1.1植酸的发现

1.2植酸的结构

1.3植酸的理化性质

1.4植酸的分布

1.5植酸的抗营养作用及对环境的影响

2植酸酶的来源

3微生物植酸酶的生产

3.1植酸酶的酶活力定义

3.2植酸酶的酶活测定方法

3.3植酸酶的筛选和测定

3.4植酸酶的生产技术

3.5统计学优化方法在微生物发酵中的应用

3.6细菌的植酸酶

3.7酵母的植酸酶

3.8真菌的植酸酶

4植酸酶的的分离纯化

5植酸酶作用的影响因素

6植酸酶的热稳定性

7植酸酶基因工程研究现状

7.1植酸酶基因的克隆与表达

7.2植酸酶的基因表达系统

8植酸酶的应用

8.1植酸酶在饲料工业中的应用

8.2植酸酶在食品工业中的应用

8.3植酸酶在医学中的应用

9海洋酵母研究进展

10本论文的研究目的与意义

11本论文研究和讨论的主要内容

第二章海洋酵母Kodamaea ohmeri BG3液体发酵生产植酸酶的研究

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果和讨论

3.1无机磷标准曲线的绘制

3.2不同底物、碳源、氮源对酶活的影响

3.3筛选显著因子

3.4显著因子的优化

3.5验证模型的可行性

3.6不同底物含磷量的测定

4本章小结

第三章海洋酵母Kodamaea ohmeri BG3液体发酵生产植酸酶及酶的分离纯化和特性研究

1前言

2材料和方法

2.1菌株

2.2培养基和试剂

2.3方法

3结果与讨论

3.1植酸酶发酵液浓缩及SephradexTM G-75凝胶层析部分纯化

3 2 DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化

3.3植酸酶纯化过程参数和不连续SDS-PAGE凝胶电泳

3.4纯化植酸酶最适温度和对温度的稳定性

3.5纯化植酸酶最适pH和对pH的稳定性

3.6金属离子对植酸酶酶活的影响

3.7蛋白抑制剂对纯化植酸酶酶活的影响

3.8动力学常数Km和最大反应速度Vmax

4本章小结

第四章Kodamaea ohmeri BG3植酸酶的基因克隆

1引言

2材料和方法

2.1菌株与质粒

2.2培养基和试剂

2.3方法

3结果和讨论

3.1植酸酶部分基因的克隆

3.2 RACE

3.3从基因组水平扩增植酸酶基因

3.4 K.ohmeri BG3植酸酶基因PHYl序列分析

3.5 K.ohmeri BG3植酸酶氨基酸序列(PHY1)分析

4本章小结

第五章K.ohmeri BG3植酸酶基因PHY1在大肠杆菌中的表达

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2培养基和试剂

2.3方法

3结果与讨论

3.1 pET-24a(+)PHY1表达载体的构建

3.2 pET-24a(+)PHY1在大肠杆菌中的诱导表达

3.3重组植酸酶的性质

4本章小结

参考文献

总结与创新点

附录 英文缩写符号及中英文对照表

博士期间发表的学术论文

致谢