海带连锁图谱构建及东方2号杂交海带亲缘关系分析

摘要

海带﹡于1927年引入我国，是我国人工栽培历史最长和产量最高的经济海藻。经过几十年的发展，海带遗传育种、育苗及栽培取得了显著成效。与海带栽培相比，目前有关海带遗传多样性分析、经济性状遗传基础等研究还比较落后。因此迫切需要一套适用的分子标记，用来构建海带连锁图谱以促进海带遗传学研究，但是目前还没有密度适中、标记适用的连锁图谱构建。 东方2号是通过海带(Laminaria japonica)的一个雌配子体克隆和长海带的一个雄配子体克隆杂交获得的，是世界上第一个大规模栽培的杂交海带，具有明显的杂种优势。东方2号是不是真正的种间杂交这个广泛关注的问题通过亲缘关系分析可以得到证明。 研究内容包括：研制海带微卫星DNA标记并分析了海带(L.japonica)和长海带(L.longissima)配子体克隆的遗传多样性，组合使用微卫星DNA标记和AFLP标记构建了海带连锁图谱，另外，分别用AFLP标记、核糖体RNA间隔区序列(ITS)中的SNP及微卫星DNA标记对东方2号杂交海带进行了亲缘关系分析。 主要结果如下： 利用FIASCO方法构建了海带(L.jaonica)(AC)n的微卫星DNA富集文库，测序得到138个含微卫星DNA片段的序列，根据所得到的序列设计了65对引物，其中有22对引物在海带配子体克隆及幼孢子体中能得到特异的扩增产物。 在36份海带配子体克隆中，微卫星DNA标记检测到的等位基因数量从2-7个不等，揭示的基因多样性在0.21到0.75之间，香农氏指数在0.37到1.55之间。长海带和海带(L.japonica)的平均等位基因数(1.5/3.3)，平均基因多样性(0.12/0.45)和平均香农氏信息指数(0.20/0.81)显著不同。根据总样本确定的前两个最丰富等位基因中，绝大多数的频率在长海带和海带(L.japonica)之间存在显著差异。长海带和海带(L.japonica)之间在基因多样性和香农氏信息指数反应的遗传多样性上的平均遗传分化分别达35.6％和36.9％。 海带(L.jaonica)雄配子体和长海带雌配子体克隆杂交获得杂交海带孢子体，从成熟孢子体分离、培养获得配子体克隆，随机取40个配子体克隆与杂交海带配子体亲本作为作图群体，利用AFLP和微卫星DNA标记分别根据杂交海带雄配子体克隆亲本特异等位基因和杂交海带雌配子体克隆亲本特异等位基因构建了两张海带连锁图谱。我们将所有标记按显性标记处理，不追究其对应的隐性等位基因。如果全都用通用性较高的微卫星DNA标记可以构建统一的一张图谱。 根据雌配子体克隆亲本特异等位基因构建的图谱包含27个连锁群共100个标记(94个AFLP和6个微卫星DNA标记)，总图距为678.4cM，图谱覆盖率为56.4％。根据雄配子体克隆亲本特异等位基因构建的图谱包含30个连锁群共121个标记(115个AFLP和6个微卫星DNA标记)，总图距为745.7cM，图谱覆盖率为53.6％。目前我们正在构建中等密度的微卫星DNA标记连锁图谱。 AFLP分析发现东方2号杂交海带和海带(L.japonica)共有的条带有70条，和长海带共有55条带，而海带(L.japonica)和长海带仅有11条带是相同的。核糖体RNA间隔区序列分析发现，东方2号在847位核苷酸存在碱基替换(T-C转换)，在海带中此位点全部为T，而在长海带中为C。东方2号在两个微卫星位点同时具有父本和母本的等位基因型。以上证据表明，东方2号是海带(L.japonica)和长海带的杂交后代。然而，根据核酮糖1，5-二磷酸羧化/氧化酶基因间隔区序列并不能确定东方2号叶绿体的来源。

目录

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声明

第一章文献综述

1海带生物学概述

1.1海带的名称及分类地位

1.2海带的应用价值

1.3海带的生活史

1.4海带生物学研究成就与应用

2分子标记概述

2.1遗传标记的发展历程

2.2几种常用的分子标记

2.3几种常用分子标记在藻类中的应用

3连锁图谱构建及应用

3.1分子遗传图谱构建的基础

3.2连锁图谱的构建方法

3.3连锁图谱的应用

4研究课题的目的及意义

第二章海带含微卫星DNA片段的筛选及微卫星DNA变异分析

0前言

1海带含微卫星DNA片段的筛选

1.1材料

1.2实验方法

2海带和长海带配子体克隆微卫星DNA多态性分析

2.1材料

2.2实验方法

3实验结果

3.1海带基因组DNA提取

3.2海带基因组DNA的酶切与连接

3.3连接产物的PCR扩增

3.4含微卫星DNA片段的筛选

3.5微卫星DNA引物设计

3.6引物扩增条件优化

3.7微卫星DNA标记对长海带和海带配子体克隆进行遗传多样性分析

3.8微卫星DNA引物通用性检测

4讨论

4.1海带DNA的提取

4.2限制性内切酶的选择

4.3探针的选择

4.4磁珠筛选结果

4.5引物设计

4.6 PCR反应条件的影响

4.7部分引物不能得到扩增产物的原因

4.8海带和长海带配子体克隆微卫星DNA多态性分析

第三章海带AFLP、微卫星DNA标记连锁图谱构建

0引言

1.材料

1.1作图群体

1.2主要试剂

1.3作图软件

2实验方法

2.1 DNA提取及浓度测定

2.2 AFLP分析

2.3微卫星DNA分析

2.4连锁图谱的构建

2.5基因组长度预测和图谱覆盖率

3实验结果

3.1 AFLP扩增结果

3.2 SSR扩增结果

3.3海带连锁图谱的构建

3.4基因组长度及图谱覆盖率

4讨论

4.1群体的选择

4.2作图标记

4.3数据处理

4.4偏分离位点

4.5分子标记连锁图谱

第四章东方2号杂交海带亲缘关系分析

0引言

1实验材料

1.1样本来源

1.2主要试剂

1.3主要软件

2实验方法

2.1 DNA提取及浓度测定

2.2 AFLP分析

2.3 ITS区域和RuBisCo基因间隔区克隆和测序

2.4微卫星DNA多样性检测

3实验结果

3.1 DNA提取

3.2 AFLP扩增

3.3 ITS区扩增

3.4 RuBisCo基因间隔区扩增

3.5 SSR检测

4讨论

展望

参考文献

致谢

个人简历

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