高效毛细管电泳及液质联用技术在中药质量控制过程中的应用

摘要

高效毛细管电泳(HPCE)技术是一种与高效液相色谱(HPLC)分离机理不同的分离技术，该技术具有分离效率高，实验消耗较少，柱系统易清洗等优点，在复杂样品的分离分析上可作为液相色谱的一种有力补充。中药材成分复杂，分离分析难度较高，本文探索性地采用高效毛细管电泳技术，对太子参、金银花、龙胆和莲子心四种药材中的有效成分进行分析，为利用该技术对中药材进行质控的可行性提供了相关理论和应用基础。本文还采用高效液相色谱．电喷雾飞行时间质谱(HPLC-ESI-TOF/MS)联用技术对龙胆和莲子心有效成分进行了分析，鉴定出了其中的多种化合物。现将本文主要研究结果归纳如下： 1．建立了测定太子参中环肽Pseudostellarin B含量的HPCE分析方法，并对10种不同产地太子参中环肽Pseudostellarin B的含量进行了测定。在此基础上进行了太子参HPCE指纹图谱研究，采用中药指纹图谱相似度计算软件对不同太子参样品的HPCE指纹图谱进行相似度计算。 2．建立了测定金银花和山银花药材中绿原酸、槲皮素和芦丁含量的高效毛细管电泳(HPCE)分析方法，并对其进行指纹图谱研究。采用加速溶剂萃取法(ASE)对药材进行提取，在选定的HPCE工作条件对金银花药材进行了含量测定。并在此基础上进行了金银花HPCE指纹图谱研究，采用中药指纹图谱相似度计算软件对。HPCE指纹图谱进行相似度计算，以系统生成的对照指纹图谱为对照模板，同一产地金银花药材指纹图谱相似度均在0.93以上，不同产地金银花药材指纹图谱相似度在0.77-0.98之间不等，且可有效区分金银花和山银花药材。 3．建立利用大孔吸附树脂对龙胆药材中龙胆苦苷和马钱子甙酸进行富集和分离纯化的方法，对D301，AB-8，D101，XDA-1四种大孔树脂对龙胆苦苷和马钱子甙酸的吸附性能进行了比较，最终确定采用D301型大孔树脂对二者进行富集、纯化。全程采用HPLC进行龙胆苦苷和马钱子甙酸浓度监测，对该过程中的工艺参数进行优化，龙胆苦苷和马钱子甙酸分别富集在8％和55％的乙醇洗脱液中，洗脱液浓缩后冷冻干燥，可得到纯度分别为74.3％和80.9％的粗产物。 4．建立了胶束电动毛细管色谱(MEKC)和微乳液毛细管电动色谱法(MEEKC)分析龙胆药材中龙胆苦苷和马钱子甙酸含量的方法。分别考察了两种分离模式下电泳介质的构成和电泳过程中的各操作参数对样品分离过程的影响，优化了MEKC和MEEKC的分析条件，在各自对应的缓冲液体系和选定的工作条件下，龙胆苦苷和马钱子甙酸与其他组分达到了基线分离，对六处不同产地的龙胆药材进行了分析，并对测定结果进行了t检验，结果表明，两种模式下，测定结果之间不存在显著性差异，而不同产地的龙胆药材的龙胆苦苷和马钱子甙酸含量之间存在较大差异。 5．建立了采用MEKC，MEEKC及非水毛细管电泳(NACE)三种模式对莲子心中的的莲心碱，异莲心碱和甲基莲心碱进行定量分析的方法。采用正交实验设计方法优化了分析条件。结果表明，三种模式均可用于莲子心药材中生物碱含量的测定及其质量控制，将其用于实际的提取物分析工作中，方法快捷，结果可靠。 6．建立HPLC-ESI-TOF/MS联用技术用于中药材龙胆有效成分含量测定及其指纹图谱研究的方法。龙胆药材ASE粗提物通过氯仿萃取分为水溶相和氯仿相，采用HPLC-DAD对龙胆苦苷和马钱子甙酸进行定量测定，并在此基础上建立龙胆药材的HPLC二元特征指纹图谱，采用HPLC-ESI-TOF/MS对指纹图谱中的特征峰进行定性。结合文献，通过各色谱峰紫外光谱和质谱数据，鉴别出了水溶相中的马钱子甙酸，阿魏酸，和龙胆苦苷三种化合物，初步判断氯仿相中的主要组分为三萜类化合物。采用中药指纹图谱相似度计算软件对不同龙胆样品的指纹图谱进行相似度计算，同批次药材指纹图谱相似度均在0.98以上，表明本文所建立的方法重现性好；6处不同产地药材水相指纹图谱相似度均在0.90以上，而氯仿相指纹图谱相似度在0.62-0.99之间不等，说明不同产地龙胆药材的质量差异主要体现在三萜类化合物上。本方法可用于龙胆药材有效成分的含量测定及质量控制。 7．发展了HPLC-DAD-ESI-TOF/MS分析莲子心中生物碱类化合物的方法，在此基础上，进行了莲子心药材的指纹图谱研究。采用加速溶剂萃取法(ASE)对莲子心进行提取，采用HPLC-DAD-ESI-TOF/MS联用技术对其中的化学成分进行分离鉴定，鉴定了其中的六种生物碱分别为：前荷叶碱，莲心季铵碱，莲心碱，异莲心碱，荷叶碱和甲基莲心碱。利用指纹图谱相似度计算软件对所得指纹图谱进行分析，产自安徽的12批莲子心药材指纹图谱相似度均在0.．98以上，证明本方法重现性较高；六处不同产地的莲子心药材指纹图谱相似度在0.76-0.99之间不等，表明不同产地莲子心药材之间存在着质量差异。本文所建立的方法重现性好，指纹图谱主要特征峰成分明确，可用于莲子心药材的质量控制。以上分析方法的建立和应用，表明高效毛细管电泳技术可应用于中药材活性成分的分离分析，液质联技术是进行中药材中化合物定性分析的有力工具，可利用二者对中药材进行有效成分的含量测定和指纹图谱研究，从而实现中药材的质量控制。

目录

声明

第1章绪论

1.1毛细管电泳技术在中药质量控制过程中的应用研究现状

1.1.1 HPCE 技术

1.1.2 HPCE在天然药物质量控制中的应用

1.1.3 HPCE在中药质量控制过程中的前景展望

1.2液相色谱色谱质谱连用技术在中药质量控制过程中的应用研究现状

1.3本文主要研究内容，创新点和科学意义

1.3.1本文主要研究内容

1.3.2创新点及科学意义

参考文献

第2章CZE测定太子参中环肽B含量以及太子参指纹图谱技术研究

2.1实验部分

2.1.1仪器与试剂

2.1.2 HPCE工作条件

2.1.3对照品及供试品溶液制备

2.2结果与讨论

2.2.1提取方法及HPCE分离条件优化

2.2.2标准曲线的绘制

2.2.3方法学考察

2.2.4不同产地太子参样品中环肽Pseudostellarin B的含量测定结果

2.2.5不同太子参样品指纹图谱的建立

2.2.6指纹图谱相似度分析

2.3小结

参考文献

第3章CZE测定金银花药材中绿原酸和黄酮类化合物及其指纹图谱研究

3.1实验部分

3.1.1仪器与试剂

3.1.2 HPCE工作条件

3.1.3对照品及供试品溶液制备

3.2结果与讨论

3.2.1提取方法及HPCE分离条件优化

3.2.2标准曲线的绘制

3.2.3方法学考察

3.2.4不同产地样品中绿原酸，芦丁和槲皮素的含量测定结果

3.2.5不同产地金银花样品指纹图谱的建立

3.2.6指纹图谱相似度分析

3.3小结

参考文献

第4章龙胆中龙胆苦苷和马钱子甙酸的大孔树脂分离纯化及其MEKC和MEEKC两种模式含量测定方法

4.1大孔吸附树脂分离纯化龙胆药材中龙胆苦苷和马钱子甙酸的研究

4.1.1仪器与试剂

4.1.2方法，结果与讨论

4.1.3小结

4.2 MEKC和MEEKC两种模式测定龙胆中龙胆苦苷和马钱子甙酸的含量

4.2.1实验部分

4.2.2结果与讨论

4.2.3小结

参考文献

第5章MEKC，MEEKC及NACE三种模式用于莲子心生物碱分析及其方法的比较

5.1实验部分

5.1.1仪器与试剂

5.1.2对照品及供试品溶液制备

5.1.3 HPCE工作条件

5.2结果与讨论

5.2.1 HPCE最佳分析条件的正交实验选择

5.2.2样品分离效果

5.2.3标准曲线的绘制

5.2.4三种模式的方法学考察及其比较

5.3小结

参考文献

第6章HPLC-DAD-ESI-TOF/MS分析龙胆中裂环烯醚萜苷类化合物及其指纹图谱研究

6.1实验部分

6.1.1仪器与试剂

6.1.2仪器工作条件

6.1.3对照品及供试品溶液制备

6.2结果与讨论

6.2.1提取方法及分析条件优化

6.2.2 ESI-TOF/MS鉴定龙胆药材提取液中的主要化合物

6.2.3龙胆苦苷和马钱子甙酸标准曲线的绘制

6.2.4方法学考察

6.2.5不同产地龙胆中龙胆苦苷和马钱子甙酸含量测定结果

6.2.6龙胆药材指纹图谱的建立

6.2.7指纹图谱相似度分析

6.3小结

参考文献

第7章HPLC-DAD-ESI-TOF/MS分析莲子心中生物碱类化合物及其指纹图谱研究

7.1实验部分

7.1.1仪器与试剂

7.1.2仪器工作条件

7.1.3供试品溶液制备

7.2结果与讨论

7.2.1提取方法及分析条件优化

7.2.2 ESI-TOF/MS鉴定莲子心药材提取液中的主要化合物

7.2.3莲子心药材指纹图谱的建立及其相似度分析

7.3小结

参考文献

第8章结论

攻读硕士期间发表文章目录

致谢