Pseudoalteromonas sp.AJ5-913的κ-卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析

摘要

本论文目的是从海洋环境筛选高活性的κ-卡拉胶酶产生菌株，对筛选菌株的产酶培养条件和培养基进行优化，在此基础上对该菌株进行诱变以提高其酶活力，纯化其κ-卡拉胶酶，并研究该酶的酶学性质，利用此酶制备κ-卡拉胶寡糖，并对其酶解产物的组成和结构进行分析，为κ-卡拉胶酶酶制剂和κ-卡拉胶寡糖的工业化生产提供理论和技术支撑。通过富集培养技术、初筛和复筛方法从多种海藻和刺参肠道筛选出33株具有κ-卡拉胶降解活性的菌株，其中从刺参肠道筛选出的AJ5菌株产酶活力最高，为1.274 U/mL。依据形态学和生理学特征及16S rRNA基因序列分析，将该菌株鉴定为假交替单胞菌属(Pseudoaltetromonas)，通过比较发现该菌株与已报道该属中的惟一一种产κ-卡拉胶酶菌P.carrageenovora有多种生理生化特征不同。通过单因素试验和正交试验对Pseudoal teromonas sp.AJ5菌株产胞外κ-卡拉胶酶的培养条件进行了优化。实验确定Pseudoalteromonas sp.AJ5菌株的最佳培养条件为：250mL三角瓶装入75 mL发酵培养基、摇床转速150 r/min、接种量7％、pH8.0、培养温度28℃：最佳培养基组成为：κ-卡拉胶1 g/L、牛肉膏2 g/L、NaCl 20g/L、K2HPO4·3H2O l g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnCl2·4H2O 0.2 g/L、FePO4·4H2O 0.01 g/L。以Pseudoal teromonas sp.AJ5菌株为出发菌株，经紫外线、甲基磺酸乙酯复合诱变和自然选育，获得一株酶活力显著提高的突变株Pseudoal teromonas sp.AJ5-913，发酵产酶活力达6.788 U/mL，比优化前提高了2.9倍。对该突变株进行液体发酵制备出κ-卡拉胶酶酶液，通过30％-80％硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-200凝胶过滤层析和CM-纤维素52阳离子交换层析技术对κ-卡拉胶酶进行纯化和精制，获得电泳纯度的酶蛋白组份，SDS--PAGE确定此κ-卡拉胶酶的分子量为35 kDa。采用Edman降解法测得该酶的N端氨基酸序列为NPTCHIAKPGETTILQECRS，通过与已报道细菌κ-卡拉胶酶的N-末端氨基酸序列比较，没有发现与该酶同样的N-末端氨基酸序列，初步确定为一新κ-卡拉胶酶。采用等电聚焦电泳测得该酶的等电点pI为8.5。通过对该酶酶学性质研究，确定该酶反应的最适pH范围为8，且酶活力在pH6.6-8.6范围内比较稳定，最适温度为55℃，酶活力在28℃下稳定，但经50℃-75℃处理30min，95％的酶活力丧失，最适NaCl浓度50 mmol/L，金属离子Zn2+，Co2+和Cu2+几乎完全抑制酶的活性。动力学参数测定结果表明，AJ5-913菌株的κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶符合米氏动力学方程，采用双倒数法作图法求得其米氏常数Km值为9.8±0.2 mg/mL。AJ5-913菌株的κ-卡拉胶酶专门水解κ-卡拉胶，对τ-和λ-卡拉胶和琼脂糖没有水解作用。利用AJ5-913菌株所产的κ-卡拉胶酶对κ-卡拉胶进行酶解制备κ-卡拉胶寡糖，通过电喷雾离子化飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)和。13C-NMR分析该酶的水解产物，确定该κ-卡拉胶酶专门水解κ-卡拉胶3，6-内醚-D-半乳糖残基和4-硫酸基-D-半乳糖之间的B-1，4糖苷键，产生3，6-内醚-D-半乳糖作为非还原端，D-半乳糖作为还原端的κ-新卡拉寡糖，主要产物是κ-新卡拉二糖硫酸盐、κ-新卡拉四糖硫酸盐、κ-新卡拉六糖硫酸盐、κ-新卡拉八糖硫酸盐和κ-新卡拉十糖硫酸盐，与已报道细菌的κ-卡拉胶酶的酶解产物有所不同。寡糖的抗病毒活性实验显示，3.12μg/mL-200μg/mL的κ-新卡拉寡糖对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的吸附有抑制作用，并且呈现明显的量效关系，表明κ-新卡拉寡糖可干扰HSV-1毒株向Vero细胞的吸附。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

0前言

1卡拉胶的研究进展

2卡拉胶及卡拉胶寡糖组成与结构的研究

3卡拉胶酶的研究进展

4卡拉胶及卡拉胶寡糖的生物学活性

参考文献

第二章κ-卡拉胶降解菌株的筛选及鉴定

0引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三章Pseudoalteromonas sp.AJ5菌株产K-卡拉胶酶的培养条件优化及诱变选育

0引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第四章Pseudoalteromonas sp.AJ5-913 κ-卡拉胶酶的分离纯化和基本酶学性质

0引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第五章Pseudoalteromonas sp.AJ5-913 K-卡拉胶酶的酶解产物分析

0引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第六章K-卡拉胶寡糖体外抗病毒活性的初步研究

0引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

论文总结

后期工作设想

致谢

博士论文工作期间发表论文情况