千金藤素对化疗药物减毒增效及抗肿瘤转移作用研究

摘要

肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，目前治疗癌症的手段主要是手术切除、放疗或化疗。对于较早期未扩散或转移的癌灶，采用手术切除或放疗较为成功，但对于发现时已处于晚期的肿瘤患者则不甚理想；而且放、化疗在杀死癌细胞的同时，对增殖旺盛的正常细胞也有一定影响，导致呕吐、腹泻、脱发和骨髓抑制等不良反应，严重影响了患者的生存质量。本课题分别从体内实验和体外实验两个方面，研究了千金藤素联合化疗药物对肿瘤的抑制作用，并探讨了其提高机体免疫力、诱导肿瘤细胞凋亡、阻止肿瘤细胞侵袭等的可能机制。 通过口服千金藤素来明确其是否对肿瘤生长具有抑制作用；进行联合化疗药物的抑瘤实验，明确千金藤素是否对化疗药具有增效作用；检测白细胞、红细胞及血清ALT和BUN等的水平、骨髓有核细胞的数目，明确千金藤素对荷瘤化疗小鼠的一般药理学指标；分析千金藤素对脾脏、胸腺指数及白细胞的DNA的影响，明确千金藤素是否具有增强免疫的作用；然后，分别采用粘附分析实验、划痕实验、人工基底膜体外重建实验、明胶酶谱分析等方法观察千金藤素对人纤维肉瘤细胞HT1080等体外侵袭过程的影响；采用吖啶橙染色和流式细胞技术检测千金藤素对肿瘤细胞凋亡的诱导作用；采用集落形成法测定千金藤素对肿瘤细胞恶性程度的影响。 实验结果表明：1．千金藤素能够剂量依赖性地抑制小鼠移植实体瘤的生长，并对化疗药物有增效减毒作用。千金藤素明显延长荷瘤(S180)小鼠的生存期，腹腔注射千金藤素(20mg/kg体重)可使U14瘤重抑制率达30.8％(P＜0.01)；可使B16-F10瘤重抑制率达35.8％(P＜0.01)。与模型组比较，小鼠生存时间延长42.6％(P＜0.01)。千金藤素与CTX联合应用时，抑瘤活性明显提高(p＜0.01)。中、高剂量千金藤素(10、20mg/kg)与CTX联用组的抑瘤率(分别为44.9％和62.5％)要高于CTX单用组(p＜0.05，p＜0.01)。中、高剂量千金藤素与CTX联用后与单独使用CTX比较，可使化疗荷瘤小鼠外周红细胞明显增多(P＜0.01)，分别提高3.7％和8.3％，可使小鼠外周血红蛋白值明显升高(P＜0.01)，分别提高7.3％和9.1％。千金藤素与CTX联用后，治疗组较正常组，白细胞下降幅度较少，与CTX组相比差异显著(P＜0.01)；单独使用CTX组的荷瘤小鼠血清ALT水平显著高于正常组(P＜0.01)，千金藤素与CTX联用后，与CTX单用组相比差异显著(P＜0.01)；千金藤素与CTX联用后，与CTX单用组相比较，小鼠骨髓有核细胞数目显著(P＜0.01)增多；千金藤素与CTX联用后，小鼠脾淋巴细胞转化率显著(P＜0.01)升高。小鼠接种U14瘤株，千金藤素与CTX联用后，荷瘤小鼠的脾脏指数、胸腺指数有明显的提升(P＜0.01)；千金藤素能够剂量依赖性地预防环磷酰胺所致DNA损伤。以上结果说明千金藤素对CTX抑瘤能够产生一定的增效减毒作用。 2．千金藤素单独作用能够浓度依赖性地抑制人纤维肉瘤细胞HT-1080、肝癌细胞SMMC7721、Hela细胞等肿瘤细胞增殖(2～40μM)，药物对上述肿瘤细胞的IC50值分别为12.37±1.64μM，12.58±1.05μM，11.83±1.33μM(处理48 hr)；而且千金藤素能够诱导肝癌细胞凋亡。经AO/EB染色后，计数凋亡细胞，4μM千金藤素处理48小时SMMC7721细胞，细胞凋亡率可达24.7％(P＜0.01)。 3．千金藤素能够抑制肿瘤细胞浸润和转移。与对照组比较，4μM药物预处理48小时后，HT1080细胞的侵袭能力显著降低(p＜0.01)。而且能够剂量依赖性地显著抑制肿瘤细胞与基底膜的粘附，减弱肿瘤细胞的运动能力和侵袭力，降低基质金属蛋白酶2(MMP-2)的活性和表达量，上调金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP-2)的表达。 4．千金藤素低浓度、长时间作用降低肿瘤恶性程度，千金藤素4μM长时间处理SMMC7721细胞株。经过50代的处理，克隆形成率逐渐降低，细胞倍增时间逐渐增加。 结论：千金藤素能够剂量依赖性地抑制小鼠移植实体瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存时间，与化疗药物环磷酰胺联用，具有一定的增效减毒作用。千金藤素抑制肿瘤生长和肿瘤细胞凋亡的作用机制与其抑制肿瘤细胞降解基底膜、增强免疫力、降低细胞恶性程度等紧密相关。千金藤素有望研究开发成为一种新型的抗肿瘤药物。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

前言

1.肿瘤

1.1肿瘤及危害

1.2肿瘤转移

1.3肿瘤的治疗

1.4机体免疫功能与肿瘤

1.5化疗与肿瘤

1.6逆转多药耐药性抗肿瘤研究进展

2.抗癌药物研究

3.抗肿瘤转移药物的研发

4.千金藤素

4.1千金藤素的药用研究

4.2千金藤素的活性

4.3千金藤素的抗肿瘤作用

4.4千金藤素在体内的吸收代谢

5.研究意义

材料和方法

1材料

1.1药品、仪器等

1.2实验动物

2体内试验

2.1体内抑瘤实验

2.2对S180荷瘤小鼠的生存期实验

2.3联合化疗药物的抑瘤实验

2.4千金藤素与化疗药物合用的一般药理学研究

2.5小鼠外周血白细胞DNA损伤测定

3体外实验

3.1细胞培养

3.2肿瘤细胞的药物预处理

3.3台盼蓝染色法计数活细胞

3.4体外侵袭实验

3.5千金藤素对肿瘤细胞粘附力影响

3.6千金藤素对肿瘤细胞运动能力的影响

3.7明胶酶谱分析实验

3.8 MMP-2表达的测定

3.9TIMP-2表达的测定Analysis of TIMP-2 expression

3.10细胞凋亡的荧光检测

3.11流式细胞术检测细胞凋亡

3.12集落形成法测定药物对肿瘤细胞克隆形成能力的影响

4.数据处理

实验结果

1.体内试验

1.1千金藤素对小鼠一般生存状况无明显影响

1.2千金藤素抑制小鼠移植实体瘤生长

1.3千金藤素能延长荷瘤小鼠生存期

1.4千金藤素与化疗药物有联合增效作用

1.5千金藤素对化疗药物有减毒作用

1.6千金藤素对小鼠一般药理学指数的影响

2.体外试验

2.1千金藤素抑制肿瘤细胞体外增殖

2.2千金藤素能够诱导肝癌细胞凋亡

2.3千金藤素能够抑制肿瘤细胞穿膜运动

2.4千金藤素减弱肿瘤细胞的粘附力

2.5千金藤素降低肿瘤细胞的运动力

2.6千金藤素能够降低MMP-2的活力

2.7千金藤素下调HT1080细胞中MMP-2的表达

2.8千金藤素升高HT1080细胞中TIMP-2的表达

3.千金藤素低浓度、长时间作用降低肿瘤恶性程度

3.1降低细胞集落形成率

3.2延长细胞倍增时间

讨 论

参考文献

致谢

个人简历

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