肌酸激酶是具有凝集素活性的抑菌因子

摘要

肌酸激酶(creatine kinase，CK)又称为肌酸磷酸激酶或磷酸肌酸激酶，属于ATP呱基磷酸转移酶家族的一员，可逆地催化ATP与ADP之间的转磷酰基反应，反应中消耗磷酸肌酸生成肌酸。从低等的海绵动物到高等的脊椎动物，众多物种中都证实有CK的存在。CK在组织能量代谢过程中发挥至关重要的作用。临床上，细胞中CK浓度和活性的变化可用于多种疾病的诊断。最近的研究表明文昌鱼体液中的CK是一种急性时相蛋白，但对其免疫功能知之甚少。本文对青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri)CK基因(BbCK)的表达和功能进行了研究。 首先，我们用Real－time PCR技术分析细菌外毒素L2S对BbCK基因表达的影响。实验结果表明，LPS处理文昌鱼能影响BbCK基因的表达，并且呈现浓度依赖性。用0.1μg/ml的LPS处理时，BbCK基因的表达水平变化甚微；用1、5和10μg/ml的LPS处理时，BbCK基因的表达水平显著升高，并分别于16小时、8小时和4小时达到峰值，这表明B6CK可能参与宿主免疫防御，与之前认为CK是文昌鱼体内一种急性时相蛋白的观点一致。 其次，为了从蛋白水平上验证文昌鱼BbCK是否参与宿主免疫防御，我们构建原核表达载体，表达、纯化并复性重组蛋白BbCK。通过抑菌活性检测实验，发现重组蛋白BbCK对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的生长无抑制作用，而对革兰氏阴性细菌大肠杆菌有明显的抑制作用。表明CK能识别入侵病原体，影响病原体的生长繁殖，从而参与宿主免疫，保护机体。 再次，为了了解BbCK是如何参与宿主免疫的，我们对重组蛋白BbCK的抑菌机制进行了初步研究。碳水化合物对其抑菌活性的影响实验表明，重组蛋白BbCK对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑制作用能被多种碳水化合物所抑制，包括：N－乙酰甘露糖胺(N－acetyl－D－mannosamine)、N－乙酰葡萄糖胺(N－acetyl－D－glucosamine)、L－岩藻糖(L－fucose)、D－甘露糖(D－mannose)、D－果糖(D－fructose)、D－葡糖糖(D－glucose)。证明CK能特异性识别革兰氏阴性菌大肠杆菌，是通过与其细胞表面的糖结合从而抑制其生长参与到宿主免疫防御，表现出凝集素的活性。 本实验是首次证明CK是具有凝集素活性的抑菌因子。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.研究脊椎动物起源与进化的珍贵模式动物--文昌鱼

1.1文昌鱼的命名和分类

1.2文昌鱼的形态结构

1.3文昌鱼的生活习性

1.4文昌鱼的胚胎发育

1.5文昌鱼免疫方面的研究进展

2.免疫系统概述

2.1无脊椎动物免疫系统

2.2脊椎动物免疫系统

3.凝集素的概述

3.1无脊椎动物凝集素

3.2文昌鱼凝集素

3.3脊椎动物凝集素

4.肌酸激酶的研究进展

4.1肌酸激酶的功能

4.2肌酸激酶的分布

4.3肌酸激酶的结构

4.4肌酸激酶的复性

5.研究目的及技术路线

5.1研究目的

5.2技术路线

第二章青岛文昌鱼肌酸激酶基因的表达和功能分析

1前言

2材料与方法

2.1 Real-time PCR分析LPS对BbCK基因表达的影响

2.2重组蛋白pET32a/BbCK的原核表达

2.3原核融合表达载体pET32a(TRX-His-tag)的表达

2.4重组蛋白BbCK复性后的酶活力测定

2.5重组蛋白BbCK复性后的抑菌活性检测

2.6碳水化合物对重组蛋白BbCK复性后抑菌活性的影响

3结果

3.1 Real-time PCR分析LPS对BbCK基因表达的影响

3.2重组蛋白pET32a/BbCK原核表达

3.3 TRX-His-tag的表达

3.4重组蛋白BbCK复性后的酶活力测定

3.5重组蛋白BbCK复性后的抑菌活性检测

3.6碳水化合物对重组蛋白BbCK复性后抑菌活性的影响

4讨论

4.1文昌鱼BbCK基因的调控表达

4.2文昌鱼BbCK基因的功能研究

5.总结与展望

参考文献

附录 缩略语

致谢

个人简历及发表的学术论文