海洋微生物高通量分离培养技术的建立及青岛近海微生物多样性研究

摘要

目前自然界中只有极少部分的海洋微生物能够得到培养，如何快速大量地分离、培养和鉴定海洋生态系统中的微生物已经成为深入研究海洋微生物生态学及大规模从海洋微生物中筛选生物活性物质的瓶颈。近年来，一些新的培养方法不断的被开发出来，主要方法如下：(1)向微生物培养基中添加信号分子；(2)稀释培养法；(3)模拟海洋微生物生长的自然环境；(4)海洋微生物的高通量分离培养技术。其中，高通量培养技术最有发展前景。它将单个细胞包埋和流式细胞仪分选结合起来。该技术在一定程度上模拟了自然环境，使所有的微生物处在一个开放的、连续的培养环境中，不破坏微生物之间的生态联系。但同时又将单个微生物分离开培养，避免了混合培养时的营养竞争问题，使大量的微生物能够获得纯培养。海洋微生物高通量分离培养技术的建立，有望培养出大量以往未被培养出的海洋微生物，这将对海洋天然活性物质的筛选以及海洋生态学的研究具有非常重要的意义。该技术可以培养各种环境中的微生物，例如海洋和土壤。目前，国内在海洋微生物的高通量分高培养方面尚未见报道。 本研究成功地建立了海洋微生物的高通量分离、培养技术。该技术的主要内容包括：(1)单个海洋微生物细胞的微囊包埋技术。将浓度为107个/ml的菌悬液与琼脂糖混合，用自行研制的微囊制备装置制备直径约50μm的微囊107个，约10％的微囊中含有单个包埋的微生物细胞。(2)微囊包埋的海洋微生物的凝胶柱高通量培养技术。将包埋有微生物的微囊置于灭过菌的25ml的凝胶柱中。出水口加8μm的滤膜，防止微囊随培养基流出，进水口加0.22μm的滤膜，防止培养基中的细菌进入凝胶柱。以灭过菌的采样点海水为培养基进行培养。流速约为10ml/小时。(3)用流式细胞仪对海洋微生物的生长情况进行高通量分析。用流式细胞仪将含菌落和不含菌落的微囊分开，并用点对点分选法将含有菌落的微囊移入96孔板，将96孔板中加入培养基后继续培养一周。然后对已获得纯培养的海洋微生物进行聚类和鉴定。从纯培养的微生物中提取基因组DNA，采用细菌16SrDNA的通用引物进行PCR扩增。将获得的16S rDNA序列与GenBank数据库中的基因序列进行相似性比较。 2008年7月31日从中国黄海冷水团区域采集海水样品，利用已建立的高通量分离培养技术，共分离纯化600株好氧异养型菌株，并对其中的32株具有不同形态特征的菌株进行了16SrDNA测序鉴定。这些菌株属于四大类群：α-变形菌纲(α-proteobacteria)(4)、γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)(12)、β-变形菌纲(β-proteobacteria)(1)、放线菌门(Firmicutes)(1)。占主导地位的是变形菌门的菌株，尤其是γ-变形菌纲。在本次研究中，我们研制了一套适合于包埋海洋微生物单个细胞的微囊制备装置，建立了一套海洋微生物的微囊分离和高通量培养技术，并且成功的培养出海洋微生物，并对其种类进行了鉴定。这是在国内首次建立的海洋微生物高通量培养方法。 2008年5月到7月间，在中国举办第29届奥运会帆船比赛的青岛近海岸发生的大规模的浒苔暴发引起了人们对环境变坏的巨大焦虑。为了估计这次浒苔暴发对海洋微生物多样性的影响，我们研究了浒苔暴发期间从青岛近海岸环境中获取的海水样品中的微生物多样性，并且跟以前的数据进行了比较。在浒苔暴发的中期(从2008年6月末到七月初)采集的三个不同的海水样品中可培养细菌的数量是4.7～6.5×104个/ml。使用四种培养基纯化保种180株好氧异养型菌株。63株典型菌株的16S rDNA序列分析表明，这些菌株属于四大类群：变形菌门(45)，放线菌门(10)，厚壁菌门(6)，拟杆菌门(2).占主导地位的是变形菌门的菌株，尤其是γ-变形菌纲。大部分菌株都是已知的菌种，6株菌可能是新种，它们属于变形菌门的4个属：Nautella，Pseudoruegeria, Pseudoalteromonas, Alteromonas。放线菌门的1个属：Salinicoccus。在这次研究中，培养出α-变形菌纲的六个属，而其中的五个属Loktanella，Jannaschia, Nautella, Phaeobacter和Pseudoruegeria都属于玫瑰杆菌群。在浒苔暴发之前的青岛近海岸海洋微生物多样性的研究中，没有发现玫瑰杆菌群的属种，说明玫瑰杆菌群确实与藻类的暴发存在相关性。其他主要的属与之前没有发生浒苔时相比也有很大的不同。据我们所知，这是第一次在大型藻类暴发时研究海洋微生物的多样性。

目录

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声明

第一章文献综述

1.大多数海洋微生物不能获得纯培养的原因

1.1 实验室的纯培养破坏了微生物细胞之问的交流

1.2培养条件与原生态环境差别太大

1.3氧化胁迫引起细胞损伤

1.4生长缓慢的微生物被忽视

1.5活的非可培养(viable but nonculturable state，VBNC)状态细菌的存在

2.目前对未培养微生物的主要研究手段

3.近年发展的海洋微生物培养新方法

3.1 向培养基中添加微生物生长所必需的成分

3.2降低培养过程中的毒害作用

3.3稀释培养法

3.4高通量培养法

3.5扩散盒培养法

3.6微囊包埋法

3.7针对放线菌的培养法

3.8根据微生物自身特性的培养方法

4.海洋微生物多样性的研究

4.1海洋微生物多样性的研究手段

4.2青岛浒苔暴发期间微生物多样性研究

5.本论文研究的目的和意义

第二章海洋微生物高通量分离培养技术的建立

1.材料与方法

1.1样品采集

1.2培养基和菌株

1.3试剂和仪器

1.4样品处理

1.5微生物包埋

1.6微囊粒径的统计

1.7培养

1.8筛选

1.9纯化、保种

1.10细菌的表型特征描述

1.11 PCR扩增及16SrDNA测序

1.12序列比对及系统树的构建

2.结果与分析

2.1海水样品计数

2.2微生物包埋

2.3微囊粒径的统计

2.4培养

2.5筛选

2.6流式细胞仪分选

2.7细菌的表型特征

2.8 32株菌的16SrDNA序列分析及系统发育分析

3.讨论

3.1海洋微生物单细胞微囊包埋法的建立

3.2试验过程中解决的技术问题

3.3对培养结果的分析

3.4与常规培养的细菌种类的比较

第三章 浒苔暴发期间青岛近岸环境可培养细菌多样性研究

1.材料与方法

1.1样品采集

1.2培养基

1.3试剂和仪器

1.4样品处理

1.5细菌的培养、纯化及保种

1.6细菌的表型特征描述

1.7 PCR扩增及16SrDNA测序

1.8序列比对及系统树的构建

1.9向GenBank提交序列

2.结果与分析

2.1海水样品计数

2.2细菌的表型特征

2.3 63株菌的16SrDNA序列分析及系统发育分析

3.讨论

参考文献

论文发表及个人简历

致谢