食物过敏原可视化检测抗体微阵列的构建

摘要

随着食物过敏发病率的逐年升高，食物过敏问题日益受到人们的重视。世界粮农组织(FAO)的报告显示超过90％的食物过敏是由八大类食物过敏原引起的。目前没有有效的食物过敏治疗方法，唯一有效的方法是避免食用含有某些特定过敏原的食物。由于极微量的过敏原即可导致严重的过敏反应，建立准确、灵敏、快速的食物过敏原检测方法对于提高食品安全的水平，保障人们的身体健康具有重要意义。
　　 由于过敏原种类繁多，能导致患者过敏的食物多种多样，如何迅速检测食品中可能含有的过敏原是广大消费者关心的问题。蛋白质微阵列技术以其高特异性，高灵敏度特别是高通量的优势引起了广大科研工作者的重视。本论文以南美白对虾(Penaeus Varmamei)、杂色蛤（Ruditapes philippinarum）、鲅鱼（Scomberomorusniphonius）、花生(Arachis hypogaea L.)为研究对象，通过对微阵列基片载体、可视化抗体微阵列的使用条件等主要因素的优化研究，建立了可视化抗体微阵列检测方法；以正交实验对可视化抗体微阵列的检测条件进行了优化，并进行了性能分析、加标实验及实际食品样品中过敏原的检测。主要结论如下：
　　 1、通过比较二维基片及三维基片对蛋白质的固定效果发现三维琼脂糖基片是可视化抗体微阵列的理想载体，最佳琼脂糖浓度为1.2％。
　　 2、通过正交实验分别确立了南美白对虾、杂色蛤、鲅鱼、花生等过敏原可视化抗体微阵列检测的最佳条件。南美白对虾可视化检测抗体微阵列的线性范围为100ng/mL～100μg/mL，检出限为100.0ng/mL；杂色蛤过敏原可视化检测抗体微阵列的线性范围为100ng/mL-100μg/mL，检出限为10.0ng/mL；鲅鱼过敏原可视化检测抗体微阵列的线性范围为1μg/mL～1mg/mL，检出限为100.0ng/mL；花生过敏原可视化检测抗体微阵列的线性范围为：1μg/mL～1mg/mL，检测限为100.0ng/mL。
　　 3、可视化抗体微阵列性能检测结果表明：该方法具有较好的精密度，批内变异系数＜10％，批间变异系数＜15％；制备的抗体微阵列玻片于4℃湿盒中密闭存放120天后，活性保持稳定；较好的特异性，仅与具有高度同源性蛋白的样品有交叉反应；加标实验结果表明该方法对不同加标样品中的过敏原检测回收率介于70％～105％。
　　 4、可视化检测抗体微阵列应用于加工食品中过敏原检测的双抗体夹心ELISA验证结果表明，所建立的可视化抗体微阵列检测方法与双抗体夹心ELISA法的阳性检出符合率为77.78％，且该方法通量化程度高、无需大型精密仪器、成本低廉、操作简便、结果直观，适于加工食品中过敏原的快速筛选。
　　 目前，针对食物过敏原的免疫检测方法的研究多集中在传统的酶免疫检测方法上，对于抗体微阵列检测方法的研究较少，可视化检测抗体微阵列检测食物过敏原的研究尚未见报道。本研究基于改良双抗体夹心ELISA法的原理，首次建立了具有良好稳定性和精密度的食物过敏原可视化抗体微阵列的检测技术。这将为食物中过敏原的筛选检测提供更加有效的技术支撑，对提高食品安全性、保护过敏人群的健康具有重要的现实意义。

目录

文摘

英文文摘

谨献

0 前言

0.1 食物过敏原概况

0.1.1 食物过敏原分类

0.1.2 食物过敏危害

0.2 食物过敏原的检测方法

0.2.1 利用人血清特异性IgE检测食物过敏原

0.2.2 用单克隆抗体或多克隆体检测食物过敏原

0.2.3 PCR分析

0.2.4 组胺释放实验(HRT)

0.2.5 指纹图谱检测技术

0.3 抗体微阵列法检测食物过敏原

0.3.1 抗体微阵列概述

0.3.2 抗体微阵列的制备

0.3.3 抗体微阵列的检测

0.4 研究目的与意义

0.5 研究思路与技术路线

1 可视化抗体微阵列检测平台的构建

1.1 引言

1.2 仪器与试剂

1.2.1 实验仪器

1.2.2 主要试剂

1.2.3 溶液的配置

1.3 实验方法

1.3.1 玻片预处理

1.3.2 玻片的硅烷修饰

1.3.3 琼脂糖三维基片的制备

1.3.4 基片的选择

1.3.5 琼脂糖浓度的选择

1.3.6 点样均一性观察

1.3.7 可视化抗体微阵列使用条件优化

1.4 结果与讨论

1.4.1 可视化抗体微阵列载体的选择

1.4.2 可视化抗体微阵列琼脂糖浓度的选择

1.4.3 点样均一性观察

1.4.4 可视化抗体微阵列使用条件优化

1.5 小结

2 食物过敏原蛋白可视化抗体微阵列检测方法的建立和初步应用

2.1 引言

2.2 实验材料与仪器

2.2.1 试剂及仪器

2.2.2 实验材料

2.2.3 溶液系统

2.3 实验方法

2.3.1 多克隆抗体的制备及纯化

2.3.2 正交实验法优化可视化抗体微阵列检测条件

2.3.3 性能检测

2.3.4 加标实验

2.4 结果与讨论

2.4.1 间接ELISA法测定抗体的效价

2.4.2 抗体纯化效果检测

2.4.3 正交实验法优化凡纳滨对虾过敏原检测条件

2.4.4 正交实验优化菲律宾蛤仔过敏原检测条件

2.4.5 正交实验优化蓝点马鲛过敏原检测条件

2.4.6 正交实验优化花生过敏原检测条件

2.4.7 性能检测

2.4.8 加标实验

2.5 小结

2.5.1 多克隆抗体的制备和纯化

2.5.2 过敏原最佳检测条件的确立

2.5.3 可视化抗体微阵列检测标准曲线的绘制及检出限的确定

2.5.4 可视化抗体微阵列性能指标的测定

2.5.5 加标回收实验

3 可视化抗体微阵列对加工食品中过敏原的检测效果评价

3.1 引言

3.2 仪器与材料

3.2.1 实验仪器

3.2.2 试剂及材料

3.3 实验方法

3.3.1 样品的抽提

3.3.2 双抗体夹心ELISA法抗体工作浓度的确立

3.3.3 样品脱脂处理

3.3.4 可视化抗体微阵列在加工食品食物过敏原检测中的应用

3.3.5 双抗体夹心ELISA在加工食品食物过敏原检测中的应用

3.4 结果与讨论

3.4.1 双抗体夹心ELISA法抗体工作浓度的确立

3.4.2 脱脂效果比对

3.4.3 双抗体夹心ELISA标准曲线的制备

3.4.4 加工食品中过敏原的检测结果

3.5 小结

3.5.1 双抗体夹心ELISA法抗体工作浓度的确立

3.5.2 脱脂效果比对

3.5.3 双抗体夹心ELISA标准曲线的绘制

3.5.4 可视化抗体微阵列检测加工食品中的过敏原

4 结论与创新点

参考文献

致谢

个人简历

发表的学术论文