白斑症病毒(WSSV)在四种宿主血细胞上结合蛋白的鉴定及抗VP28单链抗体的研制

摘要

对虾白斑症病毒（WSSV）病是危害养殖对虾最严重的病害之一，自爆发以来已对其进行了大量研究，但目前仍无切实有效的防控措施。病毒细胞受体是介导病毒入侵感染宿主细胞的门户，因此，寻找并鉴定WSSV细胞受体是弄清病毒感染机理的关键环节，也是实现白斑病防控的重要理论基础。作为WSSV重要的靶细胞之一，血细胞可作为研究WSSV病毒蛋白与宿主细胞相互作用关系的材料。本研究首先利用传统的病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）对四种不同宿主血细胞膜上WSSV结合蛋白进行鉴定，然后利用改进的VOPBA技术结合免疫荧光、蛋白质谱（MS）技术，明确了VP26与中国对虾血细胞β-actin的相互结合关系。另外，本研究利用实验室前期研制的分泌抗VP28的WSSV中和单抗杂交瘤细胞1D6，扩增编码抗体可变区基因，构建抗VP28的WSSV中和单抗可变区单链抗体（ScFV-1D6）的原核表达载体pET28a-ScFV-1D6，重组表达的ScFV-1D6复性后经体内中和试验验证其具有良好的中和WSSV感染效果。主要研究内容包括：
　　⑴利用差速离心法提取中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）、斑节对虾（Penaeus monodon）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）和克氏原螯虾（Procambarus clarkii）四种WSSV宿主的血细胞膜，并采用VOPBA技术对宿主血细胞膜上的WSSV结合蛋白进行鉴定。结果显示中国明对虾（F. chinensis）血细胞膜上存在分子量为42 kDa、72 kDa、79 kDa的3条蛋白带能够与WSSV特异性结合；斑节对虾（P. monodon）血细胞膜上存在分子量为50.5kDa、72 kDa、79 kDa的3条蛋白带能够与WSSV特异性结合；凡纳滨对虾（L. vannamei）和克氏原螯虾（P. clarkii）血细胞膜上分别有1条50.5 kDa和42 kDa蛋白带能够与WSSV结合。
　　⑵提取中国对虾血细胞膜（HmFc），并用地高辛（DIG）对其进行标记，采用改进的VOPBA技术，以DIG标记的HmFc作为探针，鉴定HmFc在WSSV上的结合蛋白，结果显示HmFc能与VP26特异性结合。为明确VP26在HmFc上的结合蛋白，原核重组表达VP26蛋白，纯化后利用荧光素FITC对其进行标记，通
　　过免疫荧光检测显示重组VP26蛋白（rVP26）能与HmFc特异性结合；应用VOPBA与MS技术鉴定出HmFc上rVP26的特异性结合蛋白为β-actin，分子量为42 kDa，提示VP26与β-actin间的结合作用在WSSV侵染过程中起重要的作用。
　　⑶利用实验室前期研制的分泌抗VP28的WSSV中和单抗杂交瘤细胞1D6，通过反转录PCR（RT-PCR）与重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术获得编码单链抗体的基因。序列分析显示单链抗体编码基因包含744个碱基，编码247个氨基酸，包括一个(Gly4Ser)3的连接短肽，一个重链可变区VH和一个轻链可变区VL。其中，VH大小为354 bp，属于抗体重链可变区基因中IGHV1S135家族；VL大小为345 bp，属于抗体轻链可变区基因中IGKV1亚群，符合小鼠免疫球蛋白可变区基因的特征。扩增获得目的基因经酶切、连接构建抗VP28的WSSV中和单抗可变区单链抗体（ ScFV-1D6）的原核表达载体pET28a-ScFV-1D6，转化大肠杆菌后，经诱导、表达、纯化与复性得到单链抗体；ELISA结果显示其具有较好的病毒结合活性；克氏原螯虾体内中和病毒感染试验结果显示ScFV-1D6可以明显延缓螯虾死亡，阻碍病毒对宿主的感染，并且中和效果随着WSSV稀释倍数的加大而增强。

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前言

1 WSSV病原学的研究

2. WSSV细胞受体的研究

3. WSSV病防控策略的研究

第二章白斑综合症病毒(WSSV)在宿主血细胞膜上结合蛋白的鉴定

2.1 WSSV在四种宿主血细胞膜上结合蛋白的初步鉴定

2.2中国对虾血细胞膜在WSSV上结合蛋白的鉴定

2.3 VP26的重组表达、纯化、标记及与血细胞结合活性检测

2.4中国对虾血细胞膜上VP26结合蛋白的鉴定

第三章抗WSSV-VP28单链抗体（ScFV-1D6）的研制

3.1抗WSSV-VP28抗体可变区编码基因的扩增

3.2 ScFV-1D6重组表达载体的构建

3.3 ScFV-1D6的重组表达、纯化与复性

3.4 ScFV-1D6 WSSV结合活性检测3.4.1实验材料

3.5螯虾体内中和WSSV感染试验

总结

参考文献

致谢

个人简历