去细胞猪角膜基质载体支架的制备及其在组织工程人角膜基质体外重建中的应用研究

摘要

人角膜基质约占全角膜厚度的90％,主要成分为人角膜基质细胞、胶原纤维及蛋白聚糖,在结构上由200-250层胶原纤维板层平行排列而成,且处于半脱水状态,在维持角膜透明及允许光线穿过中具有不可替代的作用。角膜基质缺损所致疾病具有患病率高、致盲性强和临床治疗困难等特点,在我国400余万、全世界5500余万角膜盲患者中,多数患者均为角膜基质缺损性疾病所致盲。目前,这类疾病只能通过角膜移植术来治疗,但由于捐献角膜数量的极其有限,绝大多数患者因得不到供体角膜而无法复明。体外重建的组织工程人角膜基质可以作为人角膜基质的等效替代物,使角膜基质异常性疾病的临床移植和治疗成为可能,是从根本上解决供体角膜高度匮乏问题和让众多角膜基质异常患者重见光明的唯一希望,也是决定完整组织工程人角膜能否体外重建成功的关键。为了探讨利用去细胞猪角膜基质体外重建组织工程人角膜基质的可行性,本文通过建立去细胞猪角膜基质的制备技术,并以业已建立的非转染、无致瘤性人角膜基质细胞系细胞为种子细胞、以所制备的去细胞猪角膜基质为载体支架,进行组织工程人角膜基质的体外重建研究,为利用人角膜基质细胞和去细胞猪角膜基质规模化体外重建组织工程人角膜基质奠定基础。
　　 本文采用反复冻融和0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA(1:1)混合液消化技术对新鲜猪角膜进行了脱细胞处理,经冷冻干燥后制备出了完全脱去细胞的猪角膜基质。石蜡切片的HE染色结果显示,去细胞猪角膜基质中的原有细胞已被完全去除,仅保留了前弹力层、后弹力层与完整的基质板层结构,基质层中具有去除细胞后残留下的多孔状空隙。为了使去细胞猪角膜基质的厚度与正常人角膜基质一致,本文又采用Ⅰ型胶原酶消化法对去细胞猪角膜基质进行了薄化处理。角膜测厚仪测定结果显示,消化处理后去细胞猪角膜基质的厚度470μm,正常人角膜基质的厚度相似,可以用于组织工程人角膜基质体外重建的载体支架。
　　 为了探讨去细胞猪角膜基质应用于组织工程人角膜基质体外重建的可行性,本文利用非转染、无致瘤性人角膜基质细胞系细胞对去细胞猪角膜基质进行了生物相容性研究。将薄化处理的去细胞猪角膜基质平铺于24孔培养板培养孔的底部,置37℃、5％CO2培养箱中干贴处理48 h后备用。同时,利用25 cm2培养瓶将非转染、无致瘤性人角膜基质细胞系细胞培养于含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco's Modified Eagle's Medium／Ham's Nutrient Mixture F12(DMEM／F12,1:1)培养液中,培养到对数期后利用胰酶消化和离心法收获细胞,悬浮于10％FBS-DMEM／F12培养液中,细胞计数后将细胞密度调整至5×105个／mL,向预贴有去细胞猪角膜基质的24孔培养板孔中接种1 mL上述细胞悬液,放置于37℃、5％CO2培养箱中进行体外培养。光镜观察结果显示,接种后2天,细胞数量逐渐增多；接种3 d后,去细胞猪角膜基质上人角膜基质细胞的形态依然为成纤维样,沉积细胞数量较多；接种4 d后,去细胞猪角膜基质上沉积的细胞数量开始减少；而接种后第9天观察,细胞在去细胞猪角膜内形成了均匀的多层结构；石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色结果显示,将人角膜基质细胞接种于去细胞猪角膜基质上体外培养4d后,细胞从接种的方向迁入载体支架内,而体外培养养9d后,细胞已均匀分布于载体支架内,该结果表明,人角膜基质细胞经过体外培养能迁入到去细胞猪角膜基质中,形成了近似活体角膜基质的形态结构；扫描电镜结果显示,体外重建的组织工程人角膜基质细胞绝大多数仍保持角膜基质细胞的原有形态,与在体角膜基质细胞一样呈纤维样,角膜基质细胞状态良好。上述结果表明,薄化处理的去细胞猪角膜基质与人角膜基质细胞具有理想的生物相容性,可以用作组织工程人角膜基质体外重建的载体支架。
　　 利用胰酶消化和离心法收获对数期非转染、无致瘤性人角膜基质细胞,经20μg／mL的DiI荧光染料标记处N20 min后,悬浮于10％FBS-DMEM／F12培养液中进行细胞计数,调整细胞密度至5×105个／mL,按1 mL／孔的量将细胞接种到预贴有薄化处理去细胞猪角膜基质的24孔培养板孔中,置37℃、5％CO2培养箱中进行组织工程人角膜基质的体外重建。光镜观察结果显示,接种2小时后,角膜基质细胞即粘附在猪基质面,第9天即在脱细胞猪角膜基质支架内形成均匀分布的结构。组织工程人角膜基质石蜡切片的HE染色结果显示,人角膜基质细胞迁入载体支架内,均匀分布在去细胞猪角膜基质中,形成与在体结构相似的形态结构；对第9天体外重建组织工程人角膜基质的免疫荧光检测结果显示,接种在载体支架上的组织工程人角膜基质细胞仍具有角膜基质细胞特异性的标志蛋白-波形丝蛋白；对接种后第9天体外重建的组织工程人角膜基质的扫描电镜观察结果显示,组织工程人角膜基质的种子细胞绝大多数仍保持有角膜基质细胞的原有形态,与在体角膜基质细胞一致,且细胞嵌入在胶原纤维形成的孔内,贴附于胶原纤维生长。上述结果表明,种子细胞在载体支架中生长时仍保持有角膜基质细胞的属性,能形成与在体形态相似的基质细胞均匀分布在胶原板层间的结构。
　　 综上所述,本文利用新鲜猪角膜成功制备出了去细胞猪角膜基质,经薄化处理后与人角膜基质细胞具有理想的生物相容性,进而以非转染、无致瘤性人角膜基质细胞系细胞为种子细胞、以薄化去细胞猪角膜基质为载体支架,成功体外重建出了在形态结构上与在体人角膜基质近似的组织工程人角膜基质,为组织工程人角膜基质的规模化体外重建奠定了基础。