一株海洋细菌Thalassomonas sp.LD5的琼胶酶研究

摘要

琼胶多糖由于分子量大、溶解度小、不易吸收等特点，其应用受到很大限制。而传统的化学酸解多糖制备寡糖的方法存在着反应条件难控制、降解产物不均一等问题，已成为制约琼胶寡糖应用的瓶颈。相反，利用多糖降解酶制备琼胶寡糖，具有高效、特异、低污染等优点，因此，对琼胶酶的研究具有重要的意义。目前所发现的琼胶酶多数为β-琼胶酶，而α-琼胶酶数目非常少，我们国家在α-琼胶酶的研究方面尚为空白状态，寻找新型的α-琼胶酶不仅可以填补我国在该领域的空白，同时还将丰富糖水解酶资源，促进琼胶多糖的高值化利用。
　　 前期研究中，我们从青岛海域筛选到一株能够分泌琼胶酶的菌株，对菌落的形态和16S rDNA分析显示该菌株属于Thalassomonas sp.菌属，命名为Thalassomonas sp.LD5。菌株LD5为革兰氏阴性菌，它能够在以琼脂作为唯一碳源的固体平板上生长并且产生深入平板底部的噬胶孔。分析显示LD5粗酶液中含同时还含有α-琼胶酶和β-琼胶酶，因此其粗酶液的降解产物在TLC薄层上呈现出奇偶数寡糖连续的分布形态。
　　 对LD5的发酵液采用离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析等方法分离得到一种电泳纯的琼胶酶，对其基本酶学性质进行了研究。酶的底物专一性分析结果表明，该酶能降解琼胶，且对纤维素有一定活性。SDS-PAGE电泳结果表明，该酶分子量为75kDa，这与凝胶过滤层析纯化时的参数相一致，证明其为单体形式。酶反应最适pH为7.5，在pH7.5～10之间较稳定，最适反应温度为40℃，在温度0～30℃之间较稳定。Ca2+对酶活性有显著的促进作用，且能提高酶的稳定性，当2mM Ca2+存在时，可以提高酶活70％以上。(NH4)2SO4、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Al3+、Cu2+、Ni+、Fe3+、Fe2+等多种离子以及SDS、EDTA对酶活性均有不同程度的抑制作用。产物分析显示其主产物为新琼四糖，该琼胶酶为β-琼胶酶。
　　 接下来，我们通过对已报道的α-琼胶酶基因序列的同源性比对，选择保守区域设计兼并引物，通过兼并PCR、SiteFinding PCR的方法，从LD5基因组中获得了琼胶酶基因agaD。agaD开放阅读框长4401 bp，编码1466个氨基酸，其理论分子量为158.8kDa，等电点(pI)为3.96。序列分析表明，AgaD属于GH96家族，其N端含有三个CBM6碳水化合物结合结构域，C端为催化结构域。AgaD与来自交替嗜琼胶菌Alteromonas sp.GJ1B的α-琼胶酶相似性为89％，与来自Thalassomonas sp.JAMB-A33的α-琼胶酶相似性为65％。将agaD与pET24a(+)连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建了agaD的重组表达体系，结果表明agaD在大肠杆菌中的表达量非常低，成熟蛋白的大小只有75kDa，说明AgaD存在翻译后的加工剪切。对重组酶的降解终产物进行了分析，13C-NMR分析显示其降解产物不含有α-琼胶酶降解产物的特征峰，证实这一序列与α-琼胶酶极为相似的琼胶酶其实是一个β-琼胶酶。
　　 agaD与α-琼胶酶的基因序列如此相似，但却表达出了β-琼胶酶，我们认为这本身就是一个很好的研究材料。为了提高agaD的表达量，我们尝试了带有异源信号肽的载体pET22b(+)、携带Nus融合蛋白的pET44b(+)载体和阿拉伯糖诱导表达载体pBAD，结果表明以上的系统均不能提高agaD的表达量。于是，又通过软件对agaD的密码子进行分析，发现agaD中含有较多大肠杆菌使用频率低的密码子，这可能是造成agaD表达量低的主要原因。因此，我们对agaD的催化区密码子进行了优化，并重新进行合成，结果表明优化后催化区的表达量明显提高。但是仅有催化区的重组蛋白酶活性完全丧失，因此我们怀疑其N端区域在酶的成熟过程中具有类似于分子内伴侣的重要作用，并对此假设进行了证实。
　　 我们推测，AgaD琼胶酶的β-琼胶酶属性，很可能是由于基因在进化过程中一些重要位点的突变而造成的。在后续的工作中，我们还将对此做进一步的研究。