抗菌滴眼液左氧氟沙星和利福平对人角膜内皮细胞的凋亡诱导作用研究

摘要

人角膜主要由内皮、基质和上皮及其衍生物等组成，角膜内皮细胞（HCEC）在成年后不具有再生能力，外科创伤或者疾病的治疗如青光眼的治疗、糖尿病等都会导致内皮细胞数量的减少，导致视力减弱。抗菌滴眼液在临床上的使用非常广泛，主要用来治疗角膜炎、结膜炎、沙眼等眼部疾病。本文研究对象左氧氟沙星和利福平是常用的两种抗菌滴眼液，临床浓度分别为4.88 g/L和0.5 g/L。左氧氟沙星滴眼液主要用于治疗细菌性结膜炎和角膜炎，利福平滴眼液主要用于治疗沙眼等眼表炎症。左氧氟沙星（Levofloxacin）是喹诺酮类抗生素氧氟沙星的左旋体，通过抑制细菌DNA旋转酶的活性，阻止细菌DNA的合成和复制，最终杀死细菌。利福平（Rifampicin）与细菌的RNA聚合酶结合抑制转录，达到抗菌作用。抗菌滴眼液对角膜是否存在毒性作用日益受到研究者的关注。Skelnik指出使用钙黄绿素荧光标记的方法，测定不同浓度左氧氟沙星溶液培养人角膜内皮（HCE）细胞和基质（HCK）细胞一定时间后的细胞活性，发现左氧氟沙星对HCE细胞和HCK细胞的毒性具有时间和浓度依赖性（Skelnik等，2003），但未阐明毒性产生的机制。目前利福平滴眼液常见于文献报道的多为引起严重的过敏反应，如丘疹等。本文利用实验室自建的人角膜内皮（HCE）细胞系作为实验材料，通过光镜观察、AO/EB荧光双染色、DNA琼脂糖凝胶电泳和透射电镜等方法系统研究了左氧氟沙星和利福平对体外培养的HCE细胞的影响作用，并且以家猫为实验动物进行了体内毒性作用研究，为两种抗菌滴眼液对HCE细胞的毒性作用的评价提供了实验依据。
　　观察不同浓度左氧氟沙星（0.1525g/L~4.88g/L）处理的HCE细胞，发现细胞出现拉伸变长、细胞间连接消失、皱缩变圆、脱壁死亡等形态变化，说明左氧氟沙星对HCE细胞具有毒性作用。吖啶橙/溴乙锭（AO/EB）荧光双染色结果显示，左氧氟沙星能诱导HCE细胞死亡且凋亡率具有浓度和时间依赖性，说明左氧氟沙星能够显著提高HCE细胞质膜通透性。DNA琼脂糖凝胶电泳结果证实左氧氟沙星能够诱导HCE细胞核DNA发生断片化。4.88g/L左氧氟沙星处理12h后HCE细胞的透射电镜照片结果显示，细胞出现了结构紊乱、染色质固缩、凋亡小体等细胞凋亡特征。以上实验结果证明，2.44g/L~4.88g/L的左氧氟沙星能够诱导体外培养的HCE细胞发生凋亡。
　　不同浓度利福平（0.03125g/L~0.5g/L）处理的HCE细胞出现了生长停滞、细胞间连接消失、细胞拉伸变长、胞质空泡化形态学变化，说明利福平对HCE细胞具有毒性作用。吖啶橙/溴乙锭（AO/EB）荧光双染色结果显示，利福平能诱导HCE细胞死亡且凋亡率具有浓度和时间依赖性，说明利福平能提高HCE细胞膜的通透性。DNA琼脂糖凝胶电泳证明利福平能够诱导HCE细胞核DNA发生断片化。0.5g/L利福平处理HCE细胞16h的透射电镜照片显示，细胞出现了结构紊乱、染色质固缩边缘化、凋亡小体等细胞凋亡的超微细胞结构。以上实验结果证明，0.25g/L~0.5g/L利福平能够诱导体外培养的HCE细胞发生凋亡。
　　为了验证左氧氟沙星与利福平对在体角膜内皮细胞的毒性作用，本实验利用家猫进行了动物实验。通过内皮镜、茜素红染色和扫描电镜观察结果显示，每天4次结膜下滴入左氧氟沙星或利福平滴眼液，导致家猫角膜内皮部分区域内皮细胞密度下降、面积增大、非六边形比例增大、丧失完整细胞结构、细胞皱缩等毒性作用。证明临床浓度左氧氟沙星和利福平对CCE细胞具有诱导凋亡作用。
　　本文首次利用体外培养的人角膜内皮细胞系证明了左氧氟沙星和利福平对角膜内皮细胞具有显著的毒性作用且是通过细胞凋亡引起，家猫角膜内皮细胞的在体实验进一步证实了左氧氟沙星和利福平临床浓度对角膜内皮细胞的凋亡作用。因此，临床应更谨慎合理应用两种药物，避免重复利用对角膜造成损伤，影响视力。

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第一章 文献综述

1 角膜结构与功能

2 眼表炎症及治疗药物

3 喹诺酮类药物概述

5 左氧氟沙星和利福平的毒副作用

6 细胞凋亡概述

7本研究的目的和意义

第二章 左氧氟沙星对人角膜内皮细胞的凋亡诱导作用研究

1 实验材料与仪器

2 不同浓度左氧氟沙星处理HCE细胞的实验方法

3 不同浓度左氧氟沙星处理HCE细胞的实验结果

4 讨论

5 小结

第三章 利福平对人角膜内皮细胞的凋亡诱导作用研究

1 实验材料与仪器

2 不同浓度利福平处理HCE细胞的实验方法

3 不同浓度利福平处理HCE细胞的实验结果

4讨论

5小结

第四章 左氧氟沙星和利福平对家猫角膜内皮细胞影响的活

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

全文总结

参考文献

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