对虾饵料生物携带WSSV的风险评估及红肉河蓝蛤对凡纳滨对虾抗病力的影响

摘要

对虾白斑综合征（white spot syndrome，WSS）是对虾养殖中最主要的病毒性疾病，因其高传播性、高致病性、高死亡率，对对虾产业的发展造成了巨大的阻碍。目前为止，尚缺乏有效的治疗方法，一般采取以防为主的策略。因此，建立高效、健康的生态养殖模式和提高对虾自身的抗病力是有效应对WSSV感染和传播的重要手段。天然饵料生物被认为能够提高对虾的抗病力，红肉河蓝蛤的研究尚未见报道；并且天然饵料生物也存在携带和传播WSSV的风险，关于携带的含量及强度还未有研究。所以，本论文针对上述问题主要设计了以下实验内容：
　　1、北方沿海地区不同季节饵料生物携带WSSV的情况及传播风险评估
　　本实验于2011年9月以及2012年4月、7月、9月，分4次分别对北方辽宁、天津、河北、山东、江苏“四省一市”的大连、汉沽、唐山、胶州、东营、海阳、连云港7个地区的钩虾、蜾蠃蜚、蓝蛤、拟沼螺、卤虫、红线虫等对虾饵料生物进行样品采集，采用Taqman荧光定量PCR方法检测饵料生物携带WSSV含量。
　　实验结果表明，北方7个地区对虾饵料生物携带WSSV是普遍存在的，所有饵料生物均携带病毒，但是物种之间存在明显差异。沙蚕携带WSSV量最高，蓝蛤最低，拟沼螺携带WSSV量略高于蓝蛤，但都在同一数量级；蜾蠃蜚携带WSSV量高于钩虾，卤虫携带较低量的WSSV。各地区饵料生物携带WSSV量随季节呈现变化规律，7月份病毒量最高，4月与9月较低。通过对饵料生物携带WSSV含量的检测，初步划分了4个等级（WSSV量单位为copy/mg tissue）：1级0～103为潜伏感染；2级104～105为中度感染；3级106～107为重度感染；4级108及以上WSSV爆发。本研究中所有饵料生物在4月份携带WSSV量为102和103数量级，为1级轻度潜伏感染状态；7月份为104或105数量级，为2级中度感染状态；9月份为103或104数量级，部分饵料生物为1级轻度潜伏感染，部分饵料生物为2级中度感染。
　　2、投喂红肉河蓝蛤对凡纳滨对虾生长、免疫指标和抗病力的影响
　　以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象，设计了饲料组、蓝蛤组、混合组及匀浆组4个处理以探讨投喂红肉河蓝蛤（Potamocorbula rubromuscula Zhang et Cai）对凡纳滨对虾生长、免疫指标和抗病力的影响。
　　结果显示，混合投喂和匀浆投喂的对虾生长速率显著高于投喂人工配合饲料（P<0.05），但单独投喂蓝蛤的对虾生长速率较低（P＞0.05），各处理间对虾存活率差异不显著（P＞0.05）。30天时，投喂蓝蛤和匀浆饲料可显著提高对虾的SOD和抗菌活力（P<0.05），混合投喂可显著提高对虾POD、PO和抗菌活力（P<0.05）；60天后，投喂蓝蛤可显著提高对虾血清POD和PO活力（P<0.05），混合投喂可显著提高对虾血清的POD和SOD活力（P<0.05），投喂匀浆饲料的对虾各项免疫指标和饲料组无显著性差异（P＞0.05）。采用Taqman荧光定量PCR检测发现，投喂的蓝蛤携带5.32×102 copy/mg tissue WSSV，实验期间，对虾亦携带102～103数量级WSSV，60天后饲料组对虾携带WSSV量显著高于其它处理组（P<0.05）。攻毒实验结果显示，蓝蛤组半致死时间LT50比饲料组延长24％，且蓝蛤组免疫保护率显著高于混合组和匀浆组（P<0.05）；当对虾开始出现死亡时，对虾携带WSSV病毒量超过106copy/mg tissue，蓝蛤组对虾可以耐受WSSV病毒量最高，达到8.5×108copy/mg tissue。
　　研究结果表明，鲜活蓝蛤和人工配合饲料的搭配使用以及蓝蛤软体部组织制成的匀浆饲料均能促进凡纳滨对虾的生长，但匀浆饲料应妥善保存；投喂蓝蛤能够一定程度上提高对虾非特异性免疫水平，降低潜伏感染对虾WSSV增值速率，增强急性感染对虾抵抗WSSV的能力。
　　3、饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长、免疫指标和抗病力的影响
　　本实验研究了在配合饲料中添加108CFU/g芽孢杆菌 Z5株对凡纳滨对虾生长、免疫指标和抗病力的影响。实验结果显示：芽孢杆菌组对虾生长速度较快，成活率显著提高，比对照组提高了24%的产量。饲喂21d后，芽孢杆菌组对虾血清PO活力显著升高；42d后，芽孢杆菌组对虾血清PO、POD和SOD活力均显著升高。攻毒结果表明，芽孢杆菌组对虾半数致死时间比对照组延长了35%。表明饲料添加芽孢杆菌能够提高对虾成活率，增强机体免疫功能，提高对虾抗病能力。
　　4、红肉河蓝蛤与芽孢杆菌的协同作用对凡纳滨对虾抗病力的影响
　　本实验主要采用15N人工标记的方法研究了红肉河蓝蛤滤食芽孢杆菌的同化及累积效果；养殖实验设置5个处理组，各设6个平行。饲料组：只投喂配合饲料；蓝蛤组：只投喂蓝蛤；蓝蛤+水菌组：投喂蓝蛤，水体中加入106CFU/ml芽孢杆菌，每2天换水1次，换水量为1/2，每次换水补充新的芽孢杆菌；蓝蛤+活菌组：投喂滤食芽孢杆菌的蓝蛤；蓝蛤+破碎菌组：投喂滤食破碎芽孢杆菌的蓝蛤。探讨了协同作用对凡纳滨对虾生长、免疫指标和抗病力的影响。
　　结果显示，蓝蛤能够利用芽孢杆菌，同化率为29.88%；另有部分细菌只是过路菌，蓝蛤能够携带芽孢杆菌率为18.15%。对虾摄食蓝蛤5天后，组织内对蓝蛤的同化率达到46.72%，肠道对芽孢杆菌的同化和定植率为0.24%。表明蓝蛤能够利用及携带芽孢杆菌，芽孢杆菌通过芽孢杆菌-蓝蛤-对虾食物链体系的迁移与利用作用，最终可能在对虾肠道内定植。
　　饲料组对虾成活率显著低于其它4组实验组（P<0.05）。蓝蛤组+水菌组以及蓝蛤+活菌组的对虾血清过氧化物酶活力显著高于饲料组（P<0.05）；蓝蛤+水菌组对虾血清的超氧化物歧化酶活力最高，显著高于饲料组（P<0.05）；蓝蛤组+水菌组以及蓝蛤+活菌组的对虾血清酚氧化酶活力显著高于饲料组（P<0.05）。蓝蛤+水菌组LT50比饲料组延长了61.76%，蓝蛤+活菌组延长了52.94%。结果表明，蓝蛤与芽孢杆菌能够产生协同作用，促进对虾免疫功能，提高对虾抗病力，并且活的芽孢杆菌效果优于破碎菌。

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第一章 研究综述

1 WSSV研究

2 甲壳动物免疫

3 芽孢杆菌与天然饵料生物在水产中的应用

4 本文研究目的和思路

参考文献

第二章 北方沿海地区不同季节对虾饵料生物资源初步调查及携带WSSV的风险评估

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第三章 投喂红肉河蓝蛤对凡纳滨对虾生长、免疫指标和抗病力的影响

1 前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

5 结论

参考文献

第四章 饲料中添加芽孢杆菌Z5株对凡纳滨对虾生长、免疫指标和抗病力的影响

1 前言

2 材料和方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

参 考 文 献

第五章 红肉河蓝蛤与芽孢杆菌的协同作用对凡纳滨对虾生长和抗病力的影响

1 前言

2 材料和方法

3 结果与分析

5 结论

参考文献

总 结

致谢

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