组织工程人角膜上皮-基质复合物（半角膜）体外重建及其动物移植实验的研究

摘要

角膜是位于眼睛最前方的透明组织，是行使眼屈光功能的重要组成部分。当角膜受到来自微生物、机械力、化学物和热力等作用造成损伤时，易引发各种角膜疾病，造成角膜混浊，轻者影响视力，重者甚至致盲。角膜的深度烫伤、化学灼伤及机械划伤不仅会导致上皮层的功能缺失，还会造成深度的基质创伤，需要进行移植以替代受损的上皮-基质部分。行穿透性角膜移植对角膜创伤较大，术后引发免疫排斥和新生血管的风险比板层移植要高，且角膜内皮层并没有损伤，行板层移植可以保留原内皮层和部分基质，但需要分别进行两次移植手术以分别替换受损基质和上皮，可是多次创伤修复也容易导致新生血管，影响手术预期的效果。如果能运用组织工程技术重建出组织工程半角膜（角膜上皮-基质复合物）（Tissue-engineered human hemicornea, TE-hHC），将会减少二次手术的风险，提高手术移植的效果。另外由于供体材料的缺乏，远远不能满足角膜移植手术的需要，亟需找到一种合适的材料以代替天然角膜，组织工程半角膜将会是合适的半角膜替代物，对满足角膜前板层移植的需求具有重要意义。
　　种子细胞和载体支架是体外重建TE-hHC的两大要素。目前用于组织工程的种子细胞可来源于原代细胞、干细胞及转染的细胞系，用作载体支架的材料包括天然高分子材料和合成高分子材料。但原代细胞数量少，干细胞的成功诱导还需进一步证实，转染的干细胞存在安全问题，胶原等自然高分子材料降解快、机械强度低，而合成高分子材料生物相容性差。本文采用的非转染、无致瘤性的HCEP（human corneal epithelium, HCEP）细胞和基质（human corneal stroma, HCS）细胞，具有细胞种属和功能正常，细胞生长分裂旺盛，安全性高等优点，作为重建TE-hHC的种子细胞来源。本文利用实验室业已建立的脱细胞猪角膜基质（acellular porcine corneal stroma, aPCS）制备技术工艺，制备出透明性好，与细胞有较好生物相容性的aPCS，作为体外重建TE-hHC的载体支架。
　　为了检验HCEP细胞和HCS细胞是否适合作为TE-hHC的种子细胞，本文鉴定了这两种细胞的特征。鉴定结果显示：第90代HCEP细胞和第25代HCS细胞分别呈典型的上皮样细胞形态和成纤维样细胞形态，生长与分裂旺盛，群体倍增时间分别为39.2小时和43.3小时，特征性染色体数目都仍为46，核型都为（5M+12SM+5ST+Y），二者的G带带型也均正常，且裸鼠接种实验证实二者均没有致瘤性，前者具有HCEP细胞特异性标志蛋白——角蛋白3、角蛋白12以及细胞连接蛋白 ZO-1、E-钙粘蛋白、间隙连接蛋白-43、整联蛋白β1的阳性表达，后者具有HCS细胞特异性标志蛋白——波形蛋白以及细胞连接蛋白——整联蛋白β1和间隙连接蛋白-43、功能蛋白——乙醛脱氢酶3A1、钠钾泵和钙泵的阳性表达。表明第90代HCEP细胞和第25代HCS细胞的属性和功能蛋白表达正常，适于用作TE-hHC体外重建的种子细胞。
　　本文利用本实验室业已建立的aPCS制备技术工艺，成功制备出了透明度高、机械性能好、可降解且生物相容性好的aPCS，并选用带有前弹力层的aPCS作为载体支架、选用属性和功能蛋白表达正常的第90代HCEP细胞以及第25代HCS细胞为种子细胞，进行了TE-hHC的体外重建研究。首先，采用微量注射的方法将 HCS细胞注入aPCS支架材料中，在含10％胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培养液、37℃、5% CO2的培养条件下培养24小时；其次，将HCEP细胞接种于aPCS的前弹力层面，换用10%胎牛血清的DMEM/F12（3:1）培养液采用气-液界面培养方法持续培养6天，获得TE-hHC；最后，并利用光镜观察、石蜡切片HE染色、茜素红染色、免疫组织荧光、扫描电镜和透射电镜等方法对重建所得TE-hHC的形态结构和细胞功能蛋白表达等进行了鉴定。TE-hHC的体外重建及其鉴定结果显示，TE-hHC透明度较高，aPCS支架内基质细胞伸展良好，与支架材料结合紧密；aPCS支架表面形成6-7层的复层上皮结构，表层细胞连接紧密，表面有丰富的微绒毛结构，整个上皮层细胞之间以及细胞与aPCS之间均形成了细胞连接结构，与正常半角膜的结构相近；TE-hHC的HCEP细胞和HCS细胞的特征性蛋白、功能蛋白表达均呈阳性，与正常细胞的表型和功能相同。上述结果显示，本文以带有前弹力层的aPCS为载体支架、以第90代HCEP细胞以及第25代HCS细胞为种子细胞体外重建的TE-hHC，具有与活体角膜相似的组织结构，其种子细胞并具有功能蛋白的阳性表达，表明其可能具有半角膜的生物学功能。
　　为了鉴定体外重建TE-hHC的生物学功能，本文选用比格犬和猕猴进行了TE-hHC的前板层移植实验，并通过过裂隙灯显微镜观察、角膜测厚测压等方法来评估在体TE-hHC的透明度、厚度和新生血管等特征。比格犬移植实验结果显示，在术后前期，植片水肿和炎症反应比较严重，角巩边际处形成新生血管丛，缝线处新生血管聚集，角膜表面粗糙，角膜不够透明；但随着时间推移，角膜水肿、炎症及新生血管渐渐消失，角膜透明度逐渐增加；第40天后，整个角膜已呈透明状态。猕猴移植实验结果显示，在术后前期，植片由一开始的水肿模糊状态，逐渐消肿澄清，到第30天与对照眼相比几乎完全透明；第40天后，植片依旧保持透明，愈合良好。上述动物角膜移植结果表明，本文体外重建所得TE-hHC在动物角膜中能发挥出良好的生物学功能，可作为捐献角膜的替代物用于前板层角膜移植，为角膜前板层深度损伤患者利用TE-hHC移植重见光明创造了条件。
　　综上所述，本文以细胞属性和正常功能的第90代HCEP细胞和第25代HCS细胞为种子细胞，以与这两种种子细胞具有良好生物相容性的aPCS为载体支架，成功体外重建了形态结构和功能属性与活体半角膜相似的TE-hHC，比格犬和猕猴前板层角膜移植实验证实其能发挥良好的生物学功能，有望作为捐献角膜的等效替代物用于半角膜损伤患者的临床治疗、使患者重见光明成为可能。

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第一章 前言

1 角膜的组织结构和生理功能

2 角膜病变与修复

3 组织工程角膜的研究内容

4 本文的研究目的和意义

第二章 人角膜上皮种子细胞和基质种子细胞的体外培养及其鉴定

1 材料与用品

2 方法

3 结果

4 讨论

5 本章小结

第三章 TE-hHC的体外重建及鉴定

1 材料与用品

2 方法

3 结果

4 讨论

5本章小结

第四章 TE-hHC在比格犬角膜移植中的作用研究

1 材料与用品

2 方法

3 结果

4 讨论

5 本章小结

第五章 组织工程半角膜在猕猴角膜移植中的作用研究

1 材料与用品

2 方法

3 结果

4 讨论

5 本章小结

全文总结

参考文献