南极低温酵母Guehomyces pullulans 17-1菌株中海藻糖的合成与调控

摘要

据报道，生物圈内80％的地区气温都低于5oC。低温和较少可利用的液态水，使得这些地区不适合大多数生物的生长。然而，嗜冷微生物和耐冷微生物可以在这些地区较好的生存。因此了解这些低温微生物的耐冷机制具有非常重要的意义。
　　最近研究表明，海藻糖不仅可以作为细胞内的储能物质，还可以作为一种高效的保护剂，以增强细胞组分抵抗高温、低温、高渗、高酒精浓度等极端恶劣环境的能力。
　　在酵母细胞中，海藻糖的合成途径分为两步。第一步，UDPG和6-PG在6-磷酸海藻糖合成酶（Tps1）的催化作用下生成6-磷酸海藻糖；第二步，6-磷酸海藻糖在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（Tps2）的作用下生成海藻糖。一般来说，Tps1被胞内的TPS1基因编码，而Tps2被TPS2基因进行编码。
　　在我们之前的实验中，从南极的沉积物中分离纯化得到一株耐冷酵母，经分类鉴定为Guehomyces pullulans17-1菌株，它的最适生长温度为15oC。本研究首先利用简并引物PCR法、反向PCR和基因组步移法从G. pullulans17-1菌株的基因组DNA中克隆出了TPS1基因。克隆的TPS1基因（NCBI的登录号：JX046041）全长1590bp，编码530个氨基酸，预测的蛋白分子量约为59.8kDa，该蛋白质的氨基酸序列与其它真菌的Tps1具有很高的同源性。在TPS1基因的启动子中存在若干个应激反应元件CT4和AG4，这表明TPS1基因的表达会受到逆境诱导。将培养到48h的菌体转移到新鲜的培养基中，然后分别放在10oC、15oC和25oC下培养，结果发现在25oC培养下的菌体内海藻糖的含量、Tps1酶活、TPS1基因的相对表达量比在15oC和10oC培养下的菌体要高，而在10oC培养下的菌体内海藻糖的含量、Tps1酶活、TPS1基因的相对表达量比在15oC和25oC下培养的菌体要低。这说明当G. pullulans17-1菌株处于高温逆境时，会诱导体内产生较多的海藻糖，来帮助细胞抵御高温逆境的影响；而当G. pullulans17-1菌株处于低温逆境时，并不会诱导海藻糖的大量合成。这同时也反映出了低温酵母G. pullulans17-1菌株对高温（＞20oC）比对低温（＜10oC）更加敏感，所以当它处于高温逆境时需要诱导产生大量海藻糖以适应高温环境。
　　同时利用简并引物PCR法和反向PCR法从G. pullulans17-1菌株的基因组DNA中克隆出了TPS2基因的部分序列(NCBI的登录号：KC470041),部分序列长为2376 bp，编码792个氨基酸的蛋白质。

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1 低温菌简介

2 海藻糖

3 本论文的研究内容及意义

第二章 南极低温酵母G. pullulans 17-1菌株6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆和生物学分析

1 前言

2 实验材料和方法

3结果和讨论

4 本章小结

第三章 不同温度条件下G. pullulans 17-1菌株中海藻糖的积累、Tps1酶活和TPS1基因表达的研究

1 前言

2 材料和方法

3 结果和讨论

4 本章小结

第四章 G. pullulans 17-1菌株6-磷酸海藻糖磷酸酯酶基因的部分克隆和生物学分析

1 前言

2 材料和方法

3结果和讨论

4 本章小结

论文总结与创新点

1 本论文的总结

2. 创新点

参考文献

附 录：英文缩写符号及中英文对照表

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文