文昌鱼calreticulin基因的鉴定、表达和功能研究

摘要

钙网蛋白（Calreticulin，CRT）是内质网中的主要Ca2+结合蛋白，分子大小46 kDa，由三个不同的结构功能域所组成，包括球状的N-功能域，延伸的P-功能域和酸性的C-功能域。N-末端功能域有信号肽序列，指引蛋白到达内质网，有两个半胱氨酸残基，参与二硫键的形成，不同物种间N-末端的功能域均非常保守。相比之下，C-功能域是最不保守的，但是，该区域含有一个十分保守内质网滞留序列KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)。位于N-功能域和C-功能域之间的是脯氨酸丰富的P-功能域。
　　迄今为止，CRT已经在高等植物、无脊椎动物和脊椎动物得到广泛鉴定，但是至今为止关于头索动物文昌鱼，这一个研究进化的重要的物种，报道却很少。本文我们首次克隆并鉴定得到青岛文昌鱼（Branchiostoma japonicum）的CRT的cDNA序列，命名为Bjcrt。Bjcrt全长为2848 bp，包含一个1275 bp的开放阅读框（ORF）,5'-端非翻译区（5'-UTR）87 bp,和3'-端非翻译区（3'-UTR）1486 bp的。预测文昌鱼CRT由424个氨基酸组成，分子大小为约49.5 kDa，有一个16个氨基酸残基疏水性信号肽序列，包括三个结构域(N-, P-, C-结构域)和一个内质网滞留信号，有CRT的典型特征，包括位于N-功能域的CRT家族典型特征序列KHEQKIDCGGGYI和 IMFGPDICG，P-功能域的两个三倍重复序列 A(PXXIXDPDAXKPEDWDE)和B(GXWXPPXIXNPXYX)，以及C-功能域末端的保守的内质网滞留序列（KDEL）。
　　基因结构分析显示文昌鱼和脊椎动物CRT外显子/内含子结构一样，都含有9个外显子和8个内含子，而且每个编码外显子的长度与脊椎动物CRT基因如此的相似。表明CRT在脊索动物的演化过程中高度保守，为我们提供了一个有关CRT基因转录本的调控在头索动物文昌鱼和脊椎动物中是相似的的线索。系统进化分析表明青岛文昌鱼CRT基因位于脊椎动物CRT序列底部，表明文昌鱼CRT基因是脊椎动物CRT进化的原型。
　　CRT在文昌鱼多个组织中（肝盲囊、鳃、肌肉、脊索、后肠、精巢和卵巢）特异性表达，其中在脊索中表达量最高。CRT是一个多功能蛋白，它的这种广泛的组织分布可能与在不同组织中发挥作用有关，这需要进一步展开研究。
　　我们构建文昌鱼CRT大肠杆菌体外表达系统，得到纯化的文昌鱼CRT重组蛋白BjCRT，首次验证了纯化的重组蛋白BjCRT能够结合革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌，除此之外，运用密度梯度离心的方法提起新鲜的鲈鱼巨噬细胞，使用流式细胞仪技术分析得出文昌鱼重组蛋白 BjCRT能够促进鲈鱼巨噬细胞对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的吞噬作用。文昌鱼 CRT表现出显著的调理素的功能，能够促进宿主的吞噬细胞杀死入侵的细菌。
　　综上所述，本论文研究了文昌鱼 CRT基因的克隆、鉴定和表达方式。证明了文昌鱼 CRT与革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌-大肠杆菌特异性结合，能够促进巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，首次证明了文昌鱼CRT能够发挥调理素的活性，丰富了CRT作为免疫相关分子的功能，支持CRT作为免疫相关分子参与机体的免疫反应的观点。

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第一章 引言

1文昌鱼（Branchostoma）

2 Calreticulin\(CRT\)

3 吞噬作用

4 研究目的和技术路线

第二章 文昌鱼calreticulin基因的鉴定、表达和功能研究

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

总 结

参考文献

致谢

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