凡纳滨对虾抗脂多糖因子ALF-AVK基因的克隆及其特性研究

摘要

甲壳动物在水产养殖业中占据十分重要的地位，特别是上世纪80年代以来兴起的对虾养殖行业，给我国沿海地区带来了可观的经济效益，但在养殖规模不断扩大的同时，各种疾病的爆发也给对虾养殖业带来了较多的困扰和巨大的经济损失。近年来，随着对虾病害与免疫学研究的深入，许多免疫相关因子的基因序列和功能得到了深入的研究和了解。抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factors,ALF)在甲壳动物固有免疫防御体系的识别和清除病原菌功能中起着重要的作用，对其深入的研究有助于甲壳动物疾病的防御和控制。在本论文的研究中，以凡纳滨对虾为材料，围绕其ALF（ALF-AVK）基因的克隆与其蛋白的特性分析展开了研究，主要包括以下几方面；
　　1.根据NCBI中一段类似ALF的EST序列设计引物，利用RACE技术克隆得到了凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）的一段ALF序列并根据其蛋白序列特有的丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸3个特别的氨基酸序列定名为ALF-AVK序列，该序列全长705bp，含有一个43bp的5'端非编码区（UTR），之后为396bp的开放阅读框（ORF），3'端包含有293bp的多聚赖氨酸的尾巴。ALF-AVK基因编码122个氨基酸组成的蛋白序列，分子量约为13.7kDa，等电点为9.95。
　　2.利用荧光定量PCR分析了ALF-AVK在凡纳滨对虾六种不同组织的转录水平发现，该基因在血细胞中转录水平最高，其次为鳃和心脏，而在肌肉、肝胰腺以及肠中转录处于较低的水平。同样利用qPCR技术对作为对虾体内主要免疫防御器官的血细胞在经过对虾白斑症病毒和鳗弧菌刺激之后ALF-AVK基因的转录水平变化做了研究。WSSV感染之后该基因可能由于应激作用在6h前转录水平会有一定量的升高，之后开始下降知道24h恢复正常水平，而之后随着WSSV的复制其转录水平又会出现上升直到96 h。在鳗弧菌感染组，ALF-AVK的表达量会逐渐上升直到12h到达最高峰，之后缓慢下降直到96h。
　　3.构建了pET-30a-ALF的原核表达载体，并对其进行了原核表达。使用IPTG诱导法对重组蛋白rALF-AVK进行大量诱导表达，用His标签亲和层析柱对其进行了纯化。使用纯化rALF-AVK蛋白免疫Balb/C品系小鼠后制备了多克隆抗体血清，经Western blotting检测发现多抗血清可以识别分子量为21kDa的重组蛋白并可在鳗弧菌及WSSV感染之后的对虾血细胞总蛋白14kDa的预期位置上检测到特异性条带条带。
　　4.利用间接酶联免疫反应（ELISA）和细菌-蛋白结合沉淀反应两个实验验证了ALF-AVK重组蛋白与革兰氏阴性鳗弧菌(Vibrioanguillarum)的结合活性。ELISA结果显示随着rALF-AVK蛋白浓度的增加，吸光值也会相应增加，而细菌-蛋白结合沉淀实验显示鳗弧菌与rALF-AVK孵育之后的沉淀样品中含有重组蛋白。为了验证ALF是否会参与鳗弧菌与WSSV感染对虾的过程，我们还进行了对虾体内中和反应的实验，结果显示鳗弧菌与rALF-AVK孵育之后会对对虾的死亡率有一定的推迟作用，而WSSV与rALF-AVK的孵育对死亡率并没有明显的影响。上述的实验结果证明rALF-AVK对鳗弧菌有一定的结合活性。
　　5.以纯化的ALF-AVK重组蛋白为抗原制作的鼠源多抗血清为一抗，采用石蜡切片、免疫组化技术，研究了ALF在凡纳滨对虾血细胞、鳃、心脏、肠和肝胰腺等组织器官中的分布特点。结果表明：ALF主要表达并存在于血细胞中，在鳃丝小叶边缘微血腔、心肌束间隙、肝小管间隙以及肠壁边缘有阳性信号出现。结论认为凡纳滨对虾ALF主要存在于血细胞中，而其他血液流量大的组织器官间隙也会有ALF的分布。而对比健康凡纳滨对虾与经鳗弧菌刺激之后的对虾组织发现，经过刺激之后各组织中的ALF阳性信号量会明显上升。以上的实验结果证明ALF与鳗弧菌的感染有着密切的联系。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 文 献 综 述

1.1 前言

1.2 无脊椎动物的免疫系统

1.3 抗脂多糖因子的研究进展

1.4 水产养殖对虾的重要病害

1.5 分子生物学在研究中的应用

1.6 本论文研究的目的及意义

第二章 凡纳滨对虾血细胞ALF-AVK基因的克隆及序列分析

2.1 凡纳滨对虾ALF-AVK基因的克隆

第三章 凡纳滨对虾ALF-AVK基因的表达差异研究

3.1 实验材料及仪器

3.2实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四章 凡纳滨对虾ALF-AVK蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备研究

4.1 凡纳滨对虾ALF-AVK蛋白的原核表达及纯化

4.2 重组蛋白rALF-AVK鼠源多克隆抗体的制备

4.3 免疫印迹法（Western blotting）检测ALF-AVK重组蛋白以及血细胞中ALF蛋白

第五章 凡纳滨对虾ALF-AVK重组蛋白的活性研究

5.1 实验方法

5.2 实验结果

5.3 讨论

第六章 免疫组化法研究凡纳滨对虾抗脂多糖因子ALF的组织分布特点

6.1 实验试剂及仪器

6.2实验方法

6.3 实验结果

6.4 讨论

总结

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果